邱　瑜，黃建平，周勤仙，王　歡，石回剛，何金花(吉安市婦幼保健院婦產(chǎn)科，江西吉安4000;廣州市南吉生物技術(shù)有限公司，廣東廣州5060;廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，廣東廣州5400)

Hsa-miR-218靶向調(diào)控LASP1對宮頸癌HeLa細(xì)胞生長的影響*

邱瑜1，黃建平1，周勤仙1，王歡1，石回剛2，何金花3△
(1吉安市婦幼保健院婦產(chǎn)科，江西吉安343000;2廣州市南吉生物技術(shù)有限公司，廣東廣州510630;3廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，廣東廣州511400)

［摘要］目的:探討人微小RNA-218(Homo sapiens microRNA-218，hsa-miR-218)對宮頸癌HeLa細(xì)胞生長的影響及分子機制。方法:構(gòu)建hsa-miR-218的重組慢病毒表達(dá)載體pmiR-218，并將pmiR-218感染至HeLa細(xì)胞，臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞數(shù)量的變化，WST-8法檢測細(xì)胞活力，構(gòu)建螢光素酶報告基因載體驗證miR-218與LIM和SH3蛋白1(LASP1)的相互結(jié)合作用，real-time PCR檢測LASP1的mRNA相對表達(dá)水平，Western blot檢測LASP1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:經(jīng)DNA測序證實與設(shè)計完全一致，測序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了重組慢病毒表達(dá)載體pmiR-218。pmiR-218轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞72 h后HeLa細(xì)胞存活數(shù)量為176±9，對HeLa細(xì)胞活力的抑制率具有時間效應(yīng)關(guān)系，較空白對照組比較，差異顯著(P＜0.05) ;螢光素酶活性結(jié)果顯示，克隆LASP1-3’UTR的質(zhì)粒與miR-218 mimics共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，引起螢光素酶活性的減低; real-time PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pmiR-218后，miR-218表達(dá)水平增加;過表達(dá)miR-128能下調(diào)LASP1 mRNA及蛋白的相對表達(dá)水平，與空白對照組及陰性對照組比較，差異顯著(P＜0.01)。結(jié)論: pmiR-218有效抑制HeLa細(xì)胞的生長，并具有時間-效應(yīng)關(guān)系，其機制可能是miR-218通過靶向結(jié)合LASP1的3’UTR，從而下調(diào)其在HeLa細(xì)胞的表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］人微小RNA-218; LIM和SH3蛋白1;宮頸癌; HeLa細(xì)胞

［修回日期］2015-06-19

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，其發(fā)生和發(fā)展依次經(jīng)過宮頸不典型增生、宮頸原位癌、早期浸潤癌和浸潤癌過程，因此在疾病仍處于上皮內(nèi)瘤變或原位癌的階段時及時發(fā)現(xiàn)，對于提高治療效果、改善疾病預(yù)后具有積極意義［1］。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，能夠與靶基因mRNA的3’UTR互補配對，導(dǎo)致靶mRNA的降解或翻譯抑制，參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。miRNA被明確證實為癌基因或抑癌基因［2］，miR-218在宮頸癌組織中具有抑癌作用［3］。LIM和SH3蛋白1(LIM and SH3 protein 1，LASP1)是一種肌動蛋白支架蛋白，其陽性率在宮頸癌組織中呈高表達(dá)且與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子C (vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)在宮頸癌發(fā)病中起促進(jìn)和協(xié)同作用［4］。運用生物學(xué)信息分析軟件預(yù)測到MiR-218與LASP1具有結(jié)合位點。因此，本研究通過表達(dá)miR-218，研究其對宮頸癌HeLa細(xì)胞生長的抑制作用及可能的作用機制，為臨床上宮頸癌的靶向基因治療提供依據(jù)。

材料和方法

HeLa細(xì)胞與H293T細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫; TRIzol試劑和LipofectamineTM2000購自Invitrogen;焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶及dNTP均購自Promega; dNTP、BamH I與EcroR I、T4 DNA連接酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購自TaKaRa; 1%雙抗完全培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清購自Invitrogen; SYBR Green PCR Master Mix購自TOYOBO;大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、人胚腎293T細(xì)胞(HEK 293T細(xì)胞，簡稱293T)、重組慢病毒質(zhì)粒pLVX-shRNA2、包裝質(zhì)粒PLD2及包膜質(zhì)粒PLD3均由廣州南吉生物技術(shù)有限公司提供。引物設(shè)計合成由蘇州金唯智公司合成，并經(jīng)PAGE純化。

2實驗方法

2.1慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及病毒滴度測定miR-218慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建由廣州市南吉生物技術(shù)有限公司完成，命名為pmiR-218。將重組慢病毒質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒PLD2及包膜質(zhì)粒PLD3共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染次日早上更換10 mL新鮮完全培養(yǎng)基(含1%雙抗)。收集48 h的含病毒培養(yǎng)上清，接種48孔細(xì)胞培養(yǎng)板(3×104cells/well)。10倍梯度連續(xù)稀釋病毒液，將稀釋好的病毒液各10 μL依次加入孔中。培養(yǎng)48 h后，置于倒置熒光顯微鏡下計數(shù)熒光細(xì)胞情況。用轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(transducing units，TU)定義病毒滴度，按下列公式計算病毒滴度(103TU/L)=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/視野×視野數(shù)/孔數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)÷病毒體積。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱在培養(yǎng)，每3 d傳代1次.取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，嚴(yán)格按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作進(jìn)行。實驗分為空白對照(control)組(不加轉(zhuǎn)染試劑)、pmiR-128組(含有慢病毒和LipofectamineTM2000)和陰性對照(negative control，NC)組(含LipofectamineTM2000和質(zhì)?？蛰d體慢病毒)。

2.3細(xì)胞存活數(shù)目檢測pmiR-218轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞72 h后用0.04%臺盼藍(lán)分別對3組HeLa細(xì)胞進(jìn)行染色，光鏡下計數(shù)活細(xì)胞數(shù)(其中著色細(xì)胞為死細(xì)胞)，每個樣品計數(shù)3次。

2.4WST-8法檢測細(xì)胞活力將1.0×108/L HeLa細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使pmiR-128終濃度分別為10 μg/L，每組設(shè)3個復(fù)孔，非特異性對照組終濃度為10 μg/L。置37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測吸光度(A450/A655)并按下列公式計算各組細(xì)胞活力:細(xì)胞活力抑制率(%)=(1－ApmiR-128組/A空白對照組)×100%。

2.5構(gòu)建螢光素酶報告基因載體運用生物學(xué)信息軟件預(yù)測miR-218的靶基因為LASP1 (http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/mirnapredictedtarget.php)。提取HeLa細(xì)胞基因組的DNA作為PCR擴增模板，調(diào)取LASP1全長的3’UTR序列，擴展引物分別添加Xho I和Not I酶切位點。Xho I和Not I雙酶切PCR擴增產(chǎn)物，隨后將擴增片段連接到psiCHECK-2載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌，酶切鑒定正確的陽性克隆送測序。將構(gòu)建好psiCHECK-2-LASP1-3’UTR與psi-CHECK-2-LASP1-3’UTR-mut質(zhì)粒按照以下分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染: (1) contrtol組; (2) miR-218 mimics (50 nmol/L)組; (3) negative control (50 nmol/L)組; (4) inhibitor (100 nmol/L miRNA inhibitor)組; (5) negative control inhibitor (NCI)組(50 nmol/L，作為inhibitor組的陰性對照)。RNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物的配制嚴(yán)格按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作進(jìn)行共轉(zhuǎn)染HEK293T，最后行雙熒光檢測(由廣州市萊德爾生物技術(shù)限公司完成)。

1)風(fēng)機風(fēng)筒內(nèi)氣流流動類似于管道內(nèi)氣體流動，參考管道內(nèi)氣流速度分布特征，斷面Ⅰ—Ⅰ平面內(nèi)風(fēng)流并非均用分布，機殼附近氣流速度小而靜壓大，而風(fēng)筒中心區(qū)域氣流速度大而靜壓小，而斷面Ⅰ—Ⅰ處靜壓測點布置在機殼上，因此測得斷面Ⅰ—Ⅰ靜壓大于斷面Ⅰ—Ⅰ實際平均靜壓，造成測得的風(fēng)機風(fēng)量大于真實風(fēng)量。

2.6Real-time PCR檢測LASP1 mRNA的表達(dá)水平細(xì)胞分組同2.2，用TRIzol法提取RNA，pmiR-218轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后的48 h分別于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中GFP的表達(dá)。采取TRIzol試劑提取RNA，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(RT引物為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC ACATGGTT-3’)，作為PCR反應(yīng)的模版。LASP-1的上游引物為5’-ACACTCCAGCTGGGTTGTGCTTGATCTAA-3’，下游引物為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGT-3’;擴增片段大小72 bp; U6的上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，擴增片段的大小為86 bp; GAPDH的上游引物為5’-GGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物為5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’，擴增片段的大小為94 bp。采用SYBR Green摻入法進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，94℃5 min; 94℃15 s，60℃15 s，72℃32 s，共35個循環(huán)，所有的樣本檢測均包含一個不加模板的陰性對照，以排除假陽性的結(jié)果。計算2－ΔΔCt值來比較對照組和實驗組的目的基因mRNA相對表達(dá)量的差異。

2.7Western blot檢測細(xì)胞LASP1蛋白的相對表達(dá)水平細(xì)胞分組同2.2，培養(yǎng)48 h，消化收集各組細(xì)胞。按細(xì)胞裂解液(RIPA)說明書提取細(xì)胞蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)定量結(jié)果對各蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行校正。加入樣品溶解液和樣品，置沸水中煮5 min。不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%聚丙烯酰胺分離膠和5%聚丙烯酰胺濃縮膠)，電壓80 V，進(jìn)入分離膠后改為120 V，40 min。將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，半干式轉(zhuǎn)膜15 V，18 min; TBST洗膜5 min，5%牛血清白蛋白封閉緩沖液室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。I抗4℃孵育過夜; TBST洗膜3次，每次5 min; II抗37℃孵育1 h; TBST洗膜3次，每次5 min。加入ECL試劑，顯影。BI-2000型圖像分析軟件分析IL-10和GAPDH的積分光密度，以GAPDH作為內(nèi)參照。

3統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩個樣本的均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較用Bonferroni法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1慢病毒滴度的測定及測序鑒定結(jié)果

將重組慢病毒質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒PLD2及包膜質(zhì)粒PLD3共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，于72 h收集病毒上清液，運用10倍梯度連續(xù)法測得病毒滴度為1×1011TU/L，運用熒光顯微鏡觀察到帶GFP病毒的表達(dá)。重組質(zhì)粒pmiR-218的測序結(jié)果與設(shè)計的引物序列完全相符，所含目的基因序列準(zhǔn)確無誤，表明成功構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體，見圖1。

Figure 1.Determination of lentivirus titer (A) and identification of pmiR-218 by sequencing (B).圖1慢病毒滴度的測定及pmiR-218測序鑒定

2 pmiR-218對HeLa細(xì)胞活力和生長的影響

將構(gòu)建好的慢病毒表達(dá)載體pmiR-218運用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞72 h之后，用0.04%臺盼藍(lán)對HeLa細(xì)胞進(jìn)行染色后，計算細(xì)胞的存活數(shù)目。實驗組(pmiR-218)的細(xì)胞存活數(shù)目明顯減少，較空白對照組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜ 0.05)，見圖2。

將構(gòu)建好的慢病毒表達(dá)載體pmiR-218運用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，分別在24 h、48 h和72 h檢測其細(xì)胞活力抑制率。結(jié)果顯示pmiR-128組隨著作用時間的延長，其抑制率也相應(yīng)增加，NC組的抑制率增加不明顯，pmiR-218組與NC組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。結(jié)果表明成功構(gòu)建了miR-218慢病毒表達(dá)載體，其在HeLa細(xì)胞中的過表達(dá)能有效抑制細(xì)胞活力。

Figure 2.The number of viable HeLa cells was counted by the method of Trypan blue exclusion.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group.圖2臺盼藍(lán)拒染法檢測活細(xì)胞數(shù)目

Figure 3.The inhibitory effects of pmiR-128 on the activity of HeLa cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group.圖3 pmiR-128對HeLa細(xì)胞活力的抑制作用

3 miR-128與LASP1存在相互調(diào)控作用

為了驗證miR-128可能調(diào)控的靶基因，首先運用生物學(xué)軟件(http://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_61/view_gene.cgi? taxid=9606＆rs=NM _ 006148＆members=miR-218/218a＆showcnc=0＆shownc=0)預(yù)測到LASP1與miR-128存在結(jié)合位點。將LASP1-3’UTR全長序列(2 992 bp)克隆到pisCHI-2載體上luciferase基因的下游，構(gòu)建psi-CHECK-2-LASP1-3’UTR載體，同miR-218 mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。進(jìn)一步分別檢測結(jié)合位點1(686 bp)、結(jié)合位點2(692 bp)和同時突變2個結(jié)合位點(686 bp和692 bp)確證miR-218與LASP1-3’UTR的直接結(jié)合作用。共轉(zhuǎn)染miR-218 mimics和psiCHECK-2-LASP1-3’UTR可以顯著減少luciferase的活性(P＜0.05)，而突變結(jié)合位點1、2或同時突變2個結(jié)合位點，luciferase的活性幾乎不受影響，證明miR-218通過直接結(jié)合到LASP1-3’UTR上而發(fā)揮調(diào)控作用，見圖4。

4 pmiR-218對LASP1 mRNA及miR-218在HeLa細(xì)胞中表達(dá)水平的影響

將構(gòu)建好的慢病毒表達(dá)載體pmiR-218運用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞48 h后，運用RT-PCR分別檢測LASP1 mRNA及miR-218的相對表達(dá)水平。過表達(dá)miR-218后，miR-218的表達(dá)水平明顯增加，與空白對照組及NC組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。同時LASP1 mRNA顯著下調(diào)，與空白對照組及NC組比較差異顯著(P＜0.05)，見圖5，說明過表達(dá)miR-218能下調(diào)LASP1的mRNA表達(dá)。

Figure 4.The luciferase activity in the HeLa cells after transfection.A: comparison of luciferase activity in the HeLa cells transfected with cloned LASP1-3’UTR; B: comparison of luciferase activity in the HeLa cells transfected with cloned mutant LASP1-3’UTR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control and NC group.圖4螢光素酶活性的比較

Figure 5.The effects of pmiR-218 on the relative expression levels of miR-218 (A) and LASP1 mRNA (B) in the HeLa cells.Mean ±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group and NC group.圖5 pmiR-218對LASP1 mRNA及miR-218在HeLa細(xì)胞中表達(dá)水平的影響

5 pmiR-218對LASP1蛋白相對表達(dá)水平的影響

將構(gòu)建好的慢病毒表達(dá)載體pmiR-218運用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞48 h后，運用Westerrn blot檢測LASP1蛋白的相對表達(dá)水平。過表達(dá)miR-218后，miR-218的蛋白表達(dá)水平明顯減少，與空白對照組及NC組比較差異顯著(P＜0.05)，見圖6。結(jié)果說明過表達(dá)miR-218能下調(diào)LASP1蛋白的表達(dá)。

Figure 6.The effects of pmiR-218 on the protein relative expression levels of LASP1.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group and NC group.圖6 pmiR-218對LASP1蛋白相對表達(dá)水平的影響

討論

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，鱗狀細(xì)胞癌是其最主要的病理類型，其發(fā)病率近年來呈逐漸上升趨勢。宮頸癌的病因復(fù)雜，與染色體突變、HPV感染、單核苷酸多態(tài)性變化等密切相關(guān)［5］。研究表明，miRNA可以通過與靶mRNA的3’UTR結(jié)合后堿基互補來影響靶RNA的穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)降解與翻譯偶聯(lián)以及翻譯過程中的各個重要環(huán)節(jié)，從而影響抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)［6］。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和浸潤都伴隨著miRNA表達(dá)量的變化［7］。

研究表明hsa-miR-218在腫瘤的形成中具有抑癌的作用。miR-218抑制胃癌細(xì)胞的侵龔與轉(zhuǎn)移通過靶向調(diào)控Robo1受體［8］。同時，Alajez等［9］報道m(xù)iR-218通過下調(diào)survivin基因的表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲。miR-218抑制HPV表達(dá)陽性與陰性的宮頸癌SCC細(xì)胞株增殖，其具有抑癌作用［10］。慢病毒(lentivirus)載體是以人類免疫缺陷1型病毒(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。與一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不同，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)［11］。因此，本研究選取在宮頸癌中具有抑癌作用的hsa-miR-218，構(gòu)建其慢病毒表達(dá)載體，運用質(zhì)脂體2000轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，實現(xiàn)其在細(xì)胞中的過表達(dá)，充分發(fā)揮其抑癌作用。DNA測序證實與設(shè)計完全一致，顯示成功構(gòu)建了miR-218的慢病毒表達(dá)載體pmiR-218。pmiR-218能有效抑制HeLa細(xì)胞的生長，其細(xì)胞活力抑制率在24 h、48 h和72 h分別為13%、28%和65%，并具有時間效應(yīng)關(guān)系。

LASP1是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的肌動蛋白結(jié)合蛋白和斑聯(lián)蛋白支架蛋白，在肌動蛋白組裝的多個關(guān)鍵部位如黏著斑、偽足、片足等集中。LASP1在高侵襲轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)水平顯著升高，LASP1可能是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的重要分子［12］，在正常肝組織、癌旁組織以及肝癌中的陽性表達(dá)率呈明顯的上升趨勢。LASP1可能在肝硬化導(dǎo)致肝癌發(fā)生時期就出現(xiàn)升高，且有可能成為肝硬化進(jìn)展為肝癌的早期診斷指標(biāo)［13］。LASP1陽性率在宮頸癌組高于正常宮頸組，LASP1在宮頸癌組織中具有抑癌作用［4］。為了進(jìn)一步探討miR-218與LASP1相互調(diào)控關(guān)系，我們運用生物學(xué)信息軟件TargetScan 6.2預(yù)測到miR-218的靶基因為LASP1，將克隆LASP1-3’UTR的質(zhì)粒與miR-218 mimics共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，引起螢光素酶活性的減低。結(jié)果表明miR-218與LASP1存在相互調(diào)控關(guān)系。同時，miR-218通過直接結(jié)合到LASP1-3’UTR下調(diào)LASP1 mRNA和蛋白的表達(dá)。

綜上所述，pmiR-218有效抑制HeLa細(xì)胞的生長，并具有時間-效應(yīng)關(guān)系，其機制可能是miR-218通過靶向結(jié)合LASP1的3’UTR從而下調(diào)其在HeLa細(xì)胞的表達(dá)有關(guān)。但是本研究只運用了一株細(xì)胞株作為研究對象，存在一定的不足之處，今后將研究miR-218對動物實體瘤的生物學(xué)作用及對LASP1靶向調(diào)控機制，為更深層次揭示miR-218在宮頸癌組織中發(fā)揮的抑癌作用奠定基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯:陳妙玲，羅森)

Hsa-miR-218 inhibits growth of cervical cancer HeLa cells by targeting to LASP1

QIU Yu1，HUANG Jian-ping1，ZHOU Qin-xian1，WANG Huan1，SHI Hui-gang2，HE Jinhua3
(1Department of Obstetrics＆Gynaecology，Ji’an Maternal and Child Health-Care Hospital，Ji’an 343000，China;2Nangji Biochemistry Technical Limited Company of Guangzhou，Guangzhou 510360，China;3Department of Laboratory Medicine，Central Hospital of Panyu District，Guangzhou 511400，China.E-mail: 332518579@qq.com)

［ABSTRACT］AIM: To study the effect of hsa-miR-218 on cervical cancer HeLa cell growth and the underlying molecular mechanism.METHODS: The lentivirus expression vector pmiR-218 targeting to hsa-miR-218 was constructed.pmiR-218 was transfected into HeLa cells.The number of viable HeLa cells was counted by the method of Trypan blue exclusion.The inhibitory rate of cell activity was detected by WST-8 assay.The expression of LIM and SH3 protein 1 (LASP1) at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot.The interaction between miR-218 and LASP1 was examined using a luciferase reporter assay.RESULTS: The lentivirus expression vector pmiR-218 targeting to hsa-miR-218 was constructed successfully and confirmed by DNA sequencing.Over-expression of miR-218 inhibited the activity of HeLa cells with the inhibitory rates of 15%，26% and 65% at 24 h，48 h and 72 h，respectively.The difference between transfection group and blank control/negative control group was statistically significant.The luciferase activity was reduced when co-transfection with miR-218 mimics and LASP1-3’UTR plasmid.The relative expression of miR-218 was increased after transfection with pmiR-218.Over-expression of miR-218 down-regulated the LASP1 expression at mRNA and protein levels by 25% and 75% respectively.Compared with blank control group and negative control group，the difference was statistically significant (P＜0.05).CONCLUSION: pmiR-218 effectively inhibits the growth of HeLa cells in a time-dependent manner.miR-218 targets to the 3’UTR of LASP1，thus down-regulating the expression of LASP1 in HeLa cells.

［KEY WORDS］Hsa-miR-218; LIM and SH3 protein 1; Cervical cancer; HeLa cells

通訊作者△Tel: 020-34858850; E-mail: 332518579@qq.com

*［基金項目］廣州市番禺區(qū)科技局珠江科技新星項目(No.2013-專-15-6.09)

［收稿日期］2015-01-07

［文章編號］1000-4718(2015)09-1572-06

［中圖分類號］R730.23

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.007