邱藝斌，何 堅(jiān)，蘇水珠，李 姍，羅慶祿*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué) 康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122)

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舒筋活血止痛水外擦拍打?qū)ν孟ス切躁P(guān)節(jié)炎軟骨組織MMP-1表達(dá)的影響

邱藝斌1，何 堅(jiān)2，蘇水珠1，李 姍1，羅慶祿2*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué) 康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122)

目的：觀察舒筋活血止痛水外擦拍打治療對兔膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)軟骨組織MMP-1表達(dá)的影響。方法：隨機(jī)將15只新西蘭大白兔分為正常組、模型組、拍藥組，采用前交叉韌帶切斷術(shù)(ACLT)，制作KOA模型。術(shù)后6周拍藥組進(jìn)行舒筋活血止痛水外擦拍打干預(yù)。干預(yù)2周后處死動物，采用HE染色觀察軟骨形態(tài)學(xué)改變，并進(jìn)行改良Mankin評分，免疫組化檢測MMP-1的表達(dá)情況。結(jié)果：模型組改良Mankin評分明顯增高，拍藥組改良Mankin評分低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；模型組MMP-1陽性表達(dá)顯著增強(qiáng)，拍藥組MMP-1陽性表達(dá)較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：舒筋活血止痛水外擦拍打治療可明顯降低兔KOA軟骨組織MMP-1的表達(dá)，延緩?fù)肒OA的進(jìn)展。

膝骨性關(guān)節(jié)炎；軟骨；舒筋活血止痛水；MMP-1

膝骨性關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹鞯呐R床常見骨科疾病。KOA屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”“膝痹”范疇，中醫(yī)認(rèn)為本病多為“本虛標(biāo)實(shí)”之證。舒筋活血止痛水治療KOA能起到標(biāo)本兼治的作用，臨床實(shí)踐證實(shí)用其外擦結(jié)合中醫(yī)拍打法治療KOA療效顯著，但具體機(jī)制不明。研究表明，軟骨基質(zhì)的破壞與MMP-1的增高密切相關(guān)[1-2]。因此，本研究采用舒筋活血止痛水外擦拍打干預(yù)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，通過觀察軟骨組織形態(tài)學(xué)及MMP-1表達(dá)的變化，探討舒筋活血止痛水治療的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

15只6月齡健康的新西蘭大白兔，體重(2.5±0.5)kg，由福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。15只兔隨機(jī)分為正常組、模型組、拍藥組，每組各5只。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要藥物、試劑及器材

舒筋活血止痛水由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院提供；抗兔MMP-1多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)公司，免疫組化試劑盒購于邁新生物技術(shù)公司，EDTA-2Na購于天津福晨化學(xué)試劑廠，蘇木素、伊紅染液由福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院提供；組織切片機(jī)及電子顯微鏡為德國徠卡公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 KOA造模

前交叉韌帶切除術(shù)(ACLT)是一種被廣泛應(yīng)用且有效的膝骨關(guān)節(jié)炎動物模型建立方法[3]。其原理是通過手術(shù)導(dǎo)致動物膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定，在不限制術(shù)后動物活動的情況下，造成軟骨退變磨損。除正常組外，模型組和拍藥組兔子均行右膝ACLT術(shù)。

2.2 干預(yù)方法

術(shù)后6周，對拍藥組動物進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)。固定好動物，剃除右膝關(guān)節(jié)周圍毛發(fā)，均勻涂上舒筋活血止痛水外擦劑，在膝關(guān)節(jié)周圍用食指、中指和環(huán)指第二指節(jié)掌面輕微拍打涂有舒筋活血止痛水處，以不使動物有驚恐感為度。每次10min，每天1次，連續(xù)6天為1療程，停1天，再行下1個療程，共干預(yù)2個療程。

2.3 標(biāo)本取材

空氣栓塞法處死動物，分離右側(cè)膝關(guān)節(jié)股骨髁，肉眼大體觀察軟骨組織形態(tài)，將標(biāo)本浸泡于10%EDTA-2Na脫鈣液中脫鈣，至針灸針能輕松穿透標(biāo)本后，矢狀切取股骨內(nèi)側(cè)髁相同部位大小0.5cm×0.4cm×0.2cm石蠟包埋。

2.4 組織形態(tài)學(xué)觀察

垂直軟骨面切4μm切片，采用蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光學(xué)顯微鏡觀察，按改良Mankin評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。

2.5 軟骨組織MMP-1測定

連續(xù)切片4μm，切片脫蠟入水。檸檬酸法抗原修復(fù)，置于微波爐加熱，溫度95～100℃； 3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，室溫10min；滴加血清封閉液，室溫封閉30min；滴加1∶200稀釋的抗兔MMP-1抗體，4℃孵育過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育10min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育10min； DAB室溫下顯色至滿意，清水終止顯色反應(yīng)；蘇木素復(fù)染細(xì)胞1min，PBS返藍(lán)20min；脫水透明后封片。

2.6 圖像分析

每張組織切片均在相同部位拍攝，應(yīng)用Leica Application Suite V4圖像采集軟件每張組織切片攝取4個視野，每組共20張圖片；HE染色圖片采用改良Mankin評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分；MMP-1免疫組織化學(xué)圖片采用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件測定相同面積MMP-1陽性表達(dá)的光密度值(indicator optic density，IOD)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 軟骨組織HE染色

正常組軟骨表面光滑平整，各層細(xì)胞分布均勻，排列整齊，潮線完整，著色均勻；模型組軟骨表面不平整，表層軟骨出現(xiàn)纖維化變性及軟骨缺損，有裂隙深達(dá)中、深層，各層軟骨細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)簇集現(xiàn)象，潮線中斷或出現(xiàn)多重潮線，染色不均勻，出現(xiàn)失染現(xiàn)象；拍藥組軟骨表面不平整，各層軟骨細(xì)胞排列稍不齊，可出現(xiàn)簇聚的軟骨細(xì)胞，潮線某些標(biāo)本有出現(xiàn)斷裂，個別標(biāo)本有失染現(xiàn)象(見圖1)。與正常組相比(見表1)，模型組改良Mankin評分明顯增高，組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，拍藥組評分明顯降低，組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 三組軟骨組織HE染色結(jié)果(×200)

組別例數(shù)(n)Mankin評分正常組200.95±0.89模型組208.75±1.921)拍藥組205.00±1.122)

注：與正常組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01。

3.2 軟骨MMP-1免疫組織化學(xué)染色

正常組軟骨細(xì)胞偶見散在MMP-1陽性染色，且染色較淺；模型組有大量深棕色MMP-1強(qiáng)陽性染色；拍藥組可見中等量的MMP-1陽性染色(見圖2)。三組軟骨組織MMP-1免疫組化檢測所得的IOD值組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與正常組比較(見表2)，模型組MMP-1陽性表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，拍藥組MMP-1陽性表達(dá)明顯下降，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 三組軟骨組織MMP-1免疫組化結(jié)果(×400)

組別例數(shù)(n)IOD值正常組201805.82±847.35模型組2012963.82±3977.761)拍藥組206542.65±1809.542)

注：與正常組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01。

4 討論

KOA病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，正常情況下，軟骨基質(zhì)的降解與合成保持動態(tài)平衡，而在KOA關(guān)節(jié)軟骨中則表現(xiàn)為降解大于合成，軟骨基質(zhì)破壞。金屬蛋白酶(matrix metalloproteases，MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶系，在OA發(fā)病過程中起重要作用[4-5]。其中MMP-1在MMPs家族中屬于膠原酶，能直接降解軟骨基質(zhì)中最主要的Ⅱ型膠原。研究表明，軟骨基質(zhì)的破壞與MMP-1的增高密切相關(guān)，MMP-1表達(dá)越高則軟骨破壞越嚴(yán)重[1-2]。因此，MMP-1膠原酶與KOA的病理過程密切相關(guān)，MMP-1水平的變化可以反映干預(yù)措施治療KOA的效果。

KOA屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”“膝痹”范疇，中醫(yī)認(rèn)為，痹癥發(fā)生是由風(fēng)、寒、濕邪侵犯人體，邪氣流著于關(guān)節(jié)，經(jīng)脈受阻，加之年老肝腎不足、氣血虧虛、筋骨失養(yǎng)，故本病多為“本虛標(biāo)實(shí)”之證。如《素問·痹論》指出“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”，強(qiáng)調(diào)了外邪為本病致病因素。《類證治裁·痹證》云:“諸痹……由營衛(wèi)先虛，騰理不密，風(fēng)寒濕乘虛內(nèi)襲。正氣為邪所阻，不能宣行，因而留滯，氣血凝澀，久而成痹”，闡述了本病為正氣不足，外邪乘虛侵襲經(jīng)絡(luò)所致。根據(jù)中醫(yī)病因病機(jī)，KOA的中醫(yī)療法主要為舒筋活血、補(bǔ)益肝腎、祛寒除濕、行氣止痛。臨床上，以補(bǔ)腎舒筋活血法治療KOA最為多見，不少臨床報(bào)道運(yùn)用舒筋活血法治療各種損傷療效明顯[6-7]。

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院院內(nèi)制劑舒筋活血止痛水(閩Q/YZ-2005-168)，臨床證實(shí)用其外擦結(jié)合中醫(yī)拍打法治療KOA療效顯著。該方主要由川烏、草烏、紅花、當(dāng)歸、懷牛膝、三棱、木瓜等組成，川烏、草烏、木瓜具有祛寒除濕功效；當(dāng)歸、紅花、三棱、三七能補(bǔ)血活血止痛；懷牛膝、五加皮能補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，全方標(biāo)本兼治，共奏祛寒除濕、舒筋活血、補(bǔ)益肝腎的作用，符合KOA發(fā)病的中醫(yī)病因病機(jī)。

本實(shí)驗(yàn)采用舒筋活血止痛水外擦拍打的干預(yù)方式，通過實(shí)驗(yàn)探討舒筋活血止痛水治療KOA可能的作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，舒筋活血止痛水外擦拍打治療兔KOA，在形態(tài)學(xué)上可明顯抑制軟骨破壞(見圖1、表1)。對于軟骨組織MMP-1表達(dá)的影響，同樣為拍藥組陽性表達(dá)低于模型組(見圖2、表2)，組間比較有非常顯著的差異(P<0.01)。改良Mankin評分結(jié)果與MMP-1免疫組化結(jié)果一致，說明了舒筋活血止痛水外擦拍打治療兔KOA能取得肯定療效，其起作用途徑可能是通過降低軟骨組織MMP-1的表達(dá)，從而延緩?fù)肒OA的進(jìn)展。

[1] 吳宏斌，杜靖遠(yuǎn)，胡勇，等．兔前交叉韌帶切斷骨關(guān)節(jié)炎模型中MMP-1、MMP-13及TIMP-1的mRNA表達(dá)研究[J]．中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2002，6(3)：169．

[2] 楊豐建，俞永林，喬健，等．兔骨關(guān)節(jié)炎模型的建立以及關(guān)節(jié)炎軟骨組織中MMP-1/-13的表達(dá)[J]．復(fù)旦學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2007，(4)：563-567．

[3] SAH RL，YANG AS，CHEN AC，et al．Physical properties of rabbit articular cartilage after transection of the anterior cruciate ligament [J]．Orthop Res，1997，15(2)：197-203．

[4] MURPHY G，KNAUPER V，ATKINSON S， et al．Matrix metalloproteinases in arthriticdisease [J]．A rthritis Res，2002，4(Suppl 3)：S39-49．

[5] MURPHY G，NAGASE H．Reappraising metalloproteinases in rheumatoid arthritis and osteoarthritis：destruction or repair？[J]．Nature Clinical Practice Rheumatology，2008，4(3)：128-135．

[6] 李念虎．補(bǔ)腎活血中藥治療早中期膝骨性關(guān)節(jié)炎臨床觀察[J]．中醫(yī)正骨，2006，18(10)： 11-12．

[7] 張培憲，秦學(xué)敏．中藥熏蒸膝骨性關(guān)節(jié)炎78例臨床觀察[J]．天津中醫(yī)藥，2006，23(3)：202-202．

(責(zé)任編輯：魏 曉)

Effects of Shujin huoxue zhitong shui on MMP-1 Expression in Cartilage of Rabbit Knee Osteoarthritis

Qiu Yibin1, He Jian2, Su Shuizhu1, Li Shan1, Luo Qinglu2*

(1.Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China;2.Rehabilitation Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China)

Objective:To explore the effect of shujin huoxue zhitong shui on rabbits knee osteoarthritis about the chondrocytes MMP-1 expression. Methods:Fifteen rabbits were randomly divided into three groups: normal group, model group and drug group. In addition to the normal group, the other two group rabbits received anterior cruciate ligament transaction, and the intervention carried out after six weeks. Remove the femoral condyle cartilage after two weeks' intervention. Hematoxylin-eosin staining was conducted for histological observation of rabbit articular cartilage, and the cartilage structure were assessed and quantified with the modified Mankin rating criteria; immunohistochemistry were used to assess the expressions of MMP-1 in rabbit chondrocytes. Results:The modified Mankin score is significantly higher of model group, the score of drug group is lower than model group, with a significant difference (P<0.01). There is a strong expression level of MMP-1 in the model group rabbit chondrocytes. The MMP-1 expression level is lower in drug group, with a significant difference (P<0.01). Conclusion:Shujin huoxue zhitong shui can delay the development of osteoarthritis by inhibiting the MMP-1 expressing of rabbit chondrocytes.

KOA；Cartilage；Shujin huoxue zhitong shui；MMP-1

2014-09-23

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81273774)

邱藝斌(1987-)，男，福建中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)楣桥c關(guān)節(jié)疾病的康復(fù)。

羅慶祿(1973-)，男，博士，福建中醫(yī)藥大學(xué)副教授，研究方向?yàn)楣桥c關(guān)節(jié)疾病的康復(fù)。E-mail：luo＿qinglu@126.com

R285.5

A

1673-2197(2015)03-0008-03

10.11954/ytctyy.201503004