謝 巍，蔣受軍，2*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西玉林食品藥品檢驗(yàn)所， 廣西 玉林 537000)

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HPLC法測(cè)定白背葉中大波斯菊苷含量

謝 巍1，蔣受軍1，2*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西玉林食品藥品檢驗(yàn)所， 廣西 玉林 537000)

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定白背葉藥材中大波斯菊苷含量的方法。方法：采用Gemini-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)，以甲醇-0.1%磷酸水溶液(40∶60)為流動(dòng)相，柱溫:25℃，流速:1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng):336nm。結(jié)果：大波斯菊苷達(dá)到基線分離，在0.04486～0.8972μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 3)，大波斯菊苷平均加樣回收率(n=6)為97.67%(RSD=1.94%)。結(jié)論：所建立的含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好，可用于白背葉藥材的質(zhì)量控制。

白背葉；大波斯菊苷；HPLC；含量測(cè)定

白背葉為大戟科野桐屬植物白背葉(Mallotusapelta(Lour.)Muell. Arg.)的干燥葉，又名野芙蓉、白林樹、白面虎等，具有健脾化濕、柔肝活血、收斂固脫、消炎止血等功效。主要用于慢性肝炎、肝脾腫大、脫肛、白帶、妊娠水腫、耳炎、外傷出血等[1]疾病。在我國(guó)主要分布于河南、廣西、海南、陜西、云南等地[2]。王志萍等[3-5]研究表明白背葉有一定的保肝、抗腫瘤、抗菌、止血等藥理作用。經(jīng)查閱有關(guān)文獻(xiàn)資料, 國(guó)內(nèi)外已有對(duì)白背葉中化學(xué)成分研究的報(bào)道[6-8]。大波斯菊苷具有較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞作用[9]，提示其可能為白背葉藥材所具功效的活性成分。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC測(cè)定白背葉藥材中大波斯菊苷含量的方法，以期為建立全面合理的白背葉藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

UltiMate 3000 高效液相色譜儀(Thermo Scientific)；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；AG-204電子分析天平(METTLER TOLEDO)；Millipore Simplicity-UV超純水器(美國(guó)密里博)。

白背葉由廣西金秀圣堂制藥有限公司提供, 經(jīng)廣西食品藥品檢驗(yàn)所韋家福副主任藥師鑒定為大戟科植物白背葉(Mallotusapelta(Lour) Muell-Arg)的干燥葉，標(biāo)本存放于廣西食品藥品檢驗(yàn)所中藥標(biāo)本室。大波斯菊苷對(duì)照品自行從白背葉藥材中分離、精制而得, 經(jīng)MS、H1-NMR和13C-NMR確定結(jié)構(gòu)，HPLC峰面積歸一化法測(cè)得純度均大于98% 。

水為超純水，甲醇、乙腈(美國(guó)Fisher公司，色譜純)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取105℃干燥至恒重的大波斯菊苷22.43mg，置于25mL容量瓶中，加適量70%甲醇水溶液超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含大波斯菊苷0.897 2mg的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

取白背葉藥材粉末(24目)約1.0g，精密稱定，精密加入70%甲醇水溶液25mL，稱量，加熱回流提取1.5h，放冷，用70%甲醇水溶液補(bǔ)足減失的量，濾過，取續(xù)濾液經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 色譜條件

采用Gemini-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)，以甲醇-0.1%磷酸水溶液(40:60)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)336nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL。采用外標(biāo)法計(jì)算含量，理論塔板數(shù)以大波斯菊苷計(jì)算應(yīng)不低于10 000，分離度為2.21。色譜見圖1。

圖1 大波斯菊苷對(duì)照品(A)和白背葉藥材(B)HPLC色譜(I為大波斯菊苷)

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1”項(xiàng)下大波斯菊苷對(duì)照品溶液(每1mL中含大波斯菊苷0.897 2mg)0.5、1、2、3、5和10mL，分別置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，以大波斯菊苷進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為 Y=1 594.4X-103.75,r=0.999 3，線性范圍為0.0448 6～0.897 2μg。

2.5 精密度試驗(yàn)

取白背葉藥材粉末(批號(hào)011196)約1.0g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣10μL，連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果大波斯菊苷峰面積的RSD為0.06%(n=6)，表明所用儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份白背葉供試品溶液，分別于溶液制備后0、2、4、12、24h進(jìn)樣，測(cè)定，記錄大波斯菊苷峰面積。結(jié)果大波斯菊苷峰面積的RSD分別為0.11%(n=5)，表明24h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批白背葉藥材粉末6份(批號(hào)011196)，每份約1.0g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，分別進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，并計(jì)算含量。大波斯菊苷的平均含量為24.594 mg/g，RSD為1.46%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已測(cè)定含量(每1g中含大波斯菊苷24.594mg)的白背葉藥材粉末6份，每份約0.5g，精密稱定，另精密稱大波斯菊苷對(duì)照品74.55mg置150mL量瓶中，加適量甲醇超聲使其溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別在上述6份藥材中精密加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液25mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，分別進(jìn)樣10μL，記錄大波斯菊苷的峰面積，計(jì)算含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 白背葉藥材中大波斯菊苷的回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.9 樣品含量測(cè)定

取6批不同批號(hào)的白背葉藥材粉末，每份約1.0g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL測(cè)定，記錄大波斯菊苷的峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 白背葉藥材中大波斯菊苷的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇

本研究?jī)?yōu)選了不同提取條件制備供試品溶液，考察了不同提取方法(超聲提取、回流提取)、提取時(shí)間(30、60、90min)、提取溶劑(甲醇、乙醇和70%甲醇水溶液)、溶劑用量(10、25、50mL)和藥材粉碎度(10、24、50目)對(duì)白背葉藥材中大波斯菊苷提取率的影響。結(jié)果表明白背葉藥材粉末在(24目)1.0g、加70%甲醇25mL、加熱回流提取1.5h的條件下，大波斯菊苷提取率最高。

3.2 色譜條件的選擇

曾用甲醇∶水(24∶76)梯度洗脫[7]，發(fā)現(xiàn)大波斯菊苷色譜峰的保留時(shí)間較長(zhǎng)，經(jīng)過調(diào)整流動(dòng)相及其比例，大波斯菊苷出峰時(shí)間比較適中，且峰分離度較好，因此選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液(40∶60)作流動(dòng)相。

3.3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定白背葉藥材中大波斯菊苷含量的方法，并測(cè)定了6批不同來源白背葉藥材中大波斯菊苷的含量，結(jié)果表明：不同來源白背葉藥材中的含量有一定差異性，提示采用多指標(biāo)定量方法，能更好地控制白背葉藥材質(zhì)量。

[1] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì). 中華本草(第四卷) [M].上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1999: 827.

[2] 單家林.大戟科植物的地理分布和區(qū)系特征[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),1998(4): 231.

[3] 王志萍，馮橋，沈樹虎.白背葉根提取物的體外抑菌試驗(yàn)[J].廣西中醫(yī)藥,2012,35(3):55.

[4] 趙進(jìn)軍,呂志平, 王曉東,等.白背葉根在肝纖維化動(dòng)物模型中抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥材,2002,25(3):185.

[5] 鄭作文，倫玉寧，趙麗麗.白背葉提取物芹菜素對(duì)裸鼠人胃癌細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)及凋亡的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(23):214.

[6] 韋松,曲磊,鄭作文.白背葉黃酮類化學(xué)成分研究[J]. 中成藥,2012,34(4):69.

[7] 朱斌,白桂昌, 蔣受軍,等.白背葉化學(xué)成分和含量測(cè)定研究[J].中國(guó)中藥雜志,2007, 32(10): 932.

[8] 朱斌,蔣受軍,林瑞超. GC-MS測(cè)定白背葉中的揮發(fā)油[J].華西藥學(xué)雜志,2008,23(1):35.

[9] 黃麗貞,鄭作文,唐云麗. 白背葉黃酮化合物 QB3對(duì)人腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用[J].科學(xué)技術(shù)與工程,2011,11(22):5394.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

HPLC Method for Determination of Apigenin-7-O-glucoside inMallotusapelta

Xie Wei1,Jiang Shoujun1，2*

(1.Guangxi University of Chinese medicine, Nanning 530001, China;2.YuLin Institute for Food and Drug Control,Guangxi 537000, China)

Objective:To establish an HPLC method for determination of Apigenin-7-O-glucoside inMallotusapelta. Methods:HPLC was performed on a Gemini-C18analytical column (4.6mm×250 mm, 5μm) at 25 ℃ with methanol and 0.1% Phosphoric acid (40:60) as the mobile phase.Results:The baseline separation of Apigenin-7-O-glucoside was achieved The linear ranges of 0.04486～0.8972μg (r=0.9990). The average recovery(n=6) was 97.67% (RSD=1.94%).Conclusion:The method of determination is proved to be simple, quick, repeatable, and can be used for quality control ofMallotusapelta.

Mallotusapelta；Apigenin-7-O-glucoside；HPLC；Content

2015-02-05

廣西科技創(chuàng)新能力與條件建設(shè)項(xiàng)目(桂科攻10124008-15)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2010GXNSFA013233)

謝巍(1989-)，男，廣西中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)槭称匪幤钒踩栽u(píng)價(jià)。

蔣受軍(1969-)，男，廣西玉林食品藥品檢驗(yàn)所主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)成分及中藥質(zhì)量控制。E-mail:jiangshoujun@sina.com

R284

A

1673-2197(2015)13-0016-03

10.11954/ytctyy.201513007