張雅倩，陳燕喬，王友群

(中國藥科大學(xué) 藥理研究室，江蘇 南京 210009)

?

附子干姜合用二甲雙胍對NO抑制型高血壓模型小鼠影響觀察

張雅倩，陳燕喬，王友群*

(中國藥科大學(xué) 藥理研究室，江蘇 南京 210009)

目的：探討附子干姜、二甲雙胍聯(lián)合用藥對NO抑制型高血壓模型小鼠的影響。方法：采用持續(xù)兩周灌胃給予左旋N-硝基精氨酸(L-NNA)500mg/(kg·d)的方法建立高血壓小鼠模型，將其隨機分為正常對照組、模型組、附子干姜組、二甲雙胍組、附子干姜+二甲雙胍組5組，研究附子干姜聯(lián)合二甲雙胍用藥對高血壓小鼠的降壓作用。采用小鼠頸動脈插管手術(shù)測量血壓，得出平均動脈壓(Mean Arterial Pressure, MAP)，采用紫外可見分光光度儀檢測小鼠血清、心、肝、腎組織中的NO含量及心、肝、腎組織中的丙二醛含量。結(jié)果：模型組小鼠血壓明顯高于正常組小鼠(P<0.01)，各治療組小鼠血壓均有不同程度的降低，附子干姜、二甲雙胍聯(lián)合用藥組(H組)血壓接近正常值。H組小鼠血清NO含量及心、肝、腎組織中的NO含量明顯減少(P<0.01)，心、肝、腎組織中丙二醛含量顯著降低(P<0.01)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：附子干姜、二甲雙胍聯(lián)合用藥對NO抑制型高血壓小鼠有一定的治療效果，可起到降壓和保護(hù)組織免受氧化損傷的作用，且效果優(yōu)于單獨使用附子干姜組和二甲雙胍組。

L-NNA；附子；干姜；二甲雙胍；高血壓；NO；MDA

高血壓是當(dāng)今世界最常見的慢性疾病之一，體內(nèi)一氧化氮(Nitric Oxide,NO)合成減少是其發(fā)病原因之一。研究顯示，使用NO抑制劑后能顯著升高大鼠血壓，而使用NO促進(jìn)劑后可有效降低大鼠血壓[1]。附子配伍干姜可明顯改善冠脈血流量，改善心肌受損情況，明顯升高超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量[3]。二甲雙胍為臨床一線口服降糖藥，近年研究表明，其可激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，AMPK可能通過內(nèi)皮一氧化氮(eNOS)這一途徑調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能[4]。本研究通過觀察附子干姜與二甲雙胍聯(lián)合用藥對NO抑制型高血壓小鼠模型的影響，初步探討其作用機制。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物

雄性ICR小鼠90只，體重(33±3)g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖廠，動物合格證號SCXK(蘇)2007-0001，實驗期間給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由攝食飲水，室內(nèi)溫度控制在25°C左右。

1.2 藥品與試劑

左旋N-硝基精氨酸即L-NNA(批號為16011，上海晶純試劑有限公司)；川附子(批號為20100726，購自南京億豐大藥房，經(jīng)中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院王強教授鑒定為川附子)；干姜(批號為20140628，購自南京先聲大藥房，經(jīng)中國藥科大學(xué)藥學(xué)院生藥院鑒定為干姜)；鹽酸二甲雙胍(批號為20140207，由貴州圣濟(jì)堂制藥有限公司提供)；NO、MDA試劑盒(批號均為20140710)，購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

752N紫外可見分光光度儀(上海菁華科技儀器有限公司)；RT-6000酶標(biāo)儀(深圳雷杜)；BS-110-S型電子天平(北京賽多利斯公司)；0412-1型低速離心機(上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司)。

2 方法

2.1 水煎液制備

按1∶1比例取川附子、干姜適量，加入8倍體積水浸泡30min，武火煮沸后改為文火微沸1h，用脫脂棉過濾，濾渣再加水600mL，以相同方法煮沸、過濾，合并兩次濾液，文火微沸濃縮，得到每毫升相當(dāng)于0.3g附子和0.3g干姜的水煎液。

2.2 動物分組及給藥方案

將小鼠隨機分為5組：正常對照組(C組，n=10)，模型組(M組，n=20)，附子干姜組(FG組，n=20)，二甲雙胍組(Met組，n=20)，附子干姜+二甲雙胍組(H組，n=20)。C組小鼠灌胃給予等體積相應(yīng)溶劑(吐溫-80)，M組小鼠灌胃給予L-NNA(500mg/kg)，各給藥組小鼠在給予L-NNA的基礎(chǔ)上，再分別給予FG(附子水煎劑3g/kg)，二甲雙胍組(Met 300mg/kg)，H(附子水煎劑3g/kg+二甲雙胍組300mg/kg)。各組小鼠均連續(xù)給藥14天。

2.3 考察指標(biāo)

2.3.1 動物一般情況 觀察給藥期間小鼠的身體狀況和活動情況，每天記錄體重、攝食量和飲水量。

2.3.2 生化指標(biāo) 實驗周期結(jié)束后，將小鼠眼球摘掉，取約1mL血液后立即處死，血樣在1 500r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，取上清液測定NO、MDA含量。解剖小鼠，取心臟、肝臟、胃、左側(cè)腎臟部分組織，在冰浴條件下按質(zhì)量體積比1∶9加入生理鹽水，制成10%的組織勻漿，在2 000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，取上清液，測定其中NO、MDA含量。組織蛋白含量采用考馬斯亮蘭法測定。

2.3.3 血壓 用藥2周后，采用20%烏拉坦麻醉各組小鼠，使用BL-410生物機能實驗系統(tǒng)，采用小鼠頸動脈插管手術(shù)測定血壓，記錄平穩(wěn)后的血壓變化，計算出平均動脈壓(MAP)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS11.5軟件對本實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，劑量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 動物一般情況

與正常對照C組比較，接受L-NNA灌胃給藥的各組小鼠體重均下降，攝食量也相對減少。但在給藥后3天，各給藥組小鼠體重均有不同程度的回升趨勢(見圖1)。模型組小鼠喜臥好靜，狀態(tài)萎靡，被毛發(fā)黃干枯不齊，部分小鼠死亡；與模型組相比，F(xiàn)G組和Met組小鼠狀態(tài)均有明顯改善。

圖1 實驗期間各組小鼠體重變化

3.2 各組小鼠血壓變化

與正常對照組比較，模型組小鼠血壓升高極其明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，各治療組小鼠血壓均有所下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其中附子干姜合用二甲雙胍組小鼠血壓值幾乎接近于正常對照組，治療效果最明顯，表明兩藥合用具有協(xié)同作用(見表1)。

注：與對照組比較，**P<0.01 ；與模型組比較，&&P<0.01。

3.3 附子干姜、二甲雙胍及兩藥合用對小鼠組織MDA含量影響

與正常對照組相比，模型組小鼠各組織MDA含量均顯著升高(P<0.01)。從表2可以看出，心臟氧化損傷最為嚴(yán)重，其次為腎和肝。與模型組小鼠相比，附子干姜和二甲雙胍組小鼠心臟組織MDA含量明顯下降(P<0.05)，且兩藥合用組小鼠下降更為顯著(P<0.01)；與模型組比較，附子干姜組小鼠肝臟組織MDA含量顯著下降(P<0.05)，而二甲雙胍組小鼠下降不明顯，但兩藥合用組小鼠下降極為顯著(P<0.01)；與模型組比較，附子干姜組小鼠腎臟組織MDA含量顯著下降(P<0.05)，而二甲雙胍組小鼠下降不明顯，但兩藥合用組小鼠顯著下降(P<0.01)(見表2)。

組別心肝腎C2.31±0.37**0.37±0.12**0.93±0.17**M3.25±0.62&&0.67±0.19&&1.52±0.40&&FG2.50±0.55*0.50±0.14*0.99±0.22*Met2.59±0.93*0.51±0.161.27±0.57H2.37±0.52**0.44±0.16**0.96±0.28**

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，&&P<0.01。

3.4 附子干姜、二甲雙胍及兩藥合用對小鼠組織和血清NO含量影響

與正常對照組相比，模型組小鼠各組織NO含量顯著低于對照組(P<0.01)。從表3可以看出，血清所含NO最多，其次為腎、心、肝。與模型組相比，二甲雙胍組小鼠心臟組織NO含量顯著升高(P<0.05)，而附子干姜組小鼠升高不明顯，兩藥合用組小鼠升高極其顯著(P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍組小鼠肝臟組織NO含量顯著升高(P<0.05)，而附子干姜組小鼠升高不明顯，兩藥合用組升高極其顯著(P<0.01)；與模型組比較，附子干姜和二甲雙胍組小鼠腎臟組織NO含量顯著升高(P<0.05)，且兩藥合用組小鼠升高極其顯著(P<0.01)；與模型組比較，各治療組小鼠血清NO含量升高均具有極顯著差異(P<0.01)(見表3)。

組別心肝腎血清C1.74±0.20**0.98±0.29**2.15±0.49**62.26±16.43**M1.11±0.26&&0.52±0.32&&1.19±0.49&&33.78±8.97&&FG1.47±0.510.77±0.201.75±0.42*55.48±9.57**Met1.50±0.37*0.80±0.25*1.68±0.75*61.26±13.97**H1.78±0.35**0.88±0.24**2.02±0.49**67.25±18.67**

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較，&&P<0.01。

4 討論

心血管疾病的危險因素，如高血壓、糖尿病、血脂異常、肥胖等均與內(nèi)皮性一氧化氮合酶功能受損有關(guān)，也就是說NO生成減少是導(dǎo)致上述疾病的重要原因[5]。有文獻(xiàn)研究指出，一氧化氮合酶抑制劑通過減少融合、增加分裂增殖等作用顯著改變線粒體內(nèi)機能蛋白的表達(dá)譜，同時減弱了主動脈線粒體對外來干預(yù)的適應(yīng)性。在脈管系統(tǒng)中，內(nèi)皮型一氧化氮合酶在基底和自適應(yīng)線粒體生物合成和監(jiān)管線粒體轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著重要作用[6]。由此可知，L-NNA造模后對小鼠體內(nèi)線粒體功能均有一定程度的抑制作用。二甲雙胍為常用抗糖尿病藥物，近年研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可通過AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)增加eNOS的磷酸化及其表達(dá)，增加血漿NO水平并降低全身血管阻力，起到改善內(nèi)皮功能和降低血壓的作用[7]。研究認(rèn)為，二甲雙胍通過減少活性氧簇產(chǎn)物來影響線粒體的氧化應(yīng)激性[8]。本實驗研究結(jié)束時，模型組小鼠各組織和血清中NO含量水平均低于正常組約2倍，F(xiàn)G組、Met組、H組小鼠各組織和血清中NO含量均有顯著性提高，其中H組小鼠NO含量高于正常組，說明二甲雙胍可改善內(nèi)皮一氧化氮合酶功能，增加體內(nèi)一氧化氮含量。本實驗室前期研究認(rèn)為附子干姜通過亞硝酸鹽途徑提高NO含量，因此兩藥合用可通過多途徑產(chǎn)生協(xié)同降壓效果。

本研究采用頸動脈插管測定小鼠血壓，結(jié)果表明，模型組小鼠血壓顯著升高，附子干姜組和二甲雙胍組小鼠血壓均有所下降，與文獻(xiàn)中提到的二甲雙胍能增加血清中NO含量相吻合。同時，H組小鼠血壓接近正常血壓值，提示兩藥合用療效增強。本實驗研究表明，模型組小鼠各組織MDA含量均升高，其中心臟組織MDA含量最高；各治療組小鼠MDA均有所下降，提示FG組和Met組小鼠組織損傷都受到了相應(yīng)藥物保護(hù)。H組小鼠各組織MDA含量均顯著下降，進(jìn)一步驗證了兩藥合用具有協(xié)同降壓效果。

綜上所述，附子干姜和二甲雙胍通過雙重途徑提高內(nèi)皮型一氧化氮合酶活性，升高體內(nèi)一氧化氮含量，減輕組織氧化損傷，對L-NNA所致高血壓小鼠的整體機能具有明顯改善作用，但其具體機制及更深層次的分子水平研究有待進(jìn)一步探索。

[1] 郭國慶,沈偉哉.Nω-硝基-L-精氨酸和谷氨酸單氨鈉對高血壓大鼠心率、血壓及腦卒中的影響[J].暨南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版,2002,23(6):10-15.

[2] CHANG H R, LEE R P, WU C Y, et al. Nitric oxide in mesenteric vascular reactivity: a comparison between rats with normotension and hypertension[J].Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,2002,29(4):275-280.

[3] 黃穎,武乾,石曉路,等.附子、干姜配伍機制現(xiàn)代研究概述[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2013,31(9):1884-1886.

[4] CHEN ZP,MITCHEHILL KI,MICHELL BJ,et al.AMP-activated protein kinase phosphorrylation of endothelial NO synthase[J].FEBS Letters,1999,443(3):285-289.

[5] MILLER MW, KNAUB LA, OLIVERA FRAGOSO LF, et al. Nitric oxide regulates vascular adaptive mitochondrial dynamics[J].American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology,2013,304(12):H1624-H1633.

[6] COOPER CE, GIULIVI C. Nitric oxide regulation of mitochondrial oxygen consumption II: molecular mechanism and tissue physiology[J].American Journal of Physiology-Cell Physiology,2007,292(6):C1993-C2003.

[7] MATHER KJ,VERMA S,ANDERSON TJ. Improved endothelial function with metformin in type 2 diabetes mellitus[J].Journal of the American College of Cardiology,2001,37(5): 1344-1350.

[8] HOU X,SONG J,LI XN,et al. Metformin reduces intracellular reactive oxygen species levels by upregulating expression of the antioxidant thioredoxin via the AMPK-FOXO3 pathway[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2010,396(2):199-205.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

The Effects and Interactions ofRadixAconitiLateralis Preparata Combined with Rhizome Zingiberis and Metformin on NOS Inhibitied Mice

Zhang Yaqian, Chen Yanqiao, Wang Youqun*

(Department of Pharmacology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

Objective:To observe the therapeutic effects ofRadixAconitiLateralis Preparata combined with Rhizoma Zingiberis or metformin alone and their combination on NOS inhibition induced hypertensive mice.Methods:The Nitric oxide synthase (NOS) inhibition-induced hypertension model was established by intragastric administration with L-NNA(500mg/kg)for two weeks. To study the combination antihypertensive effect of high blood pressure in mice; Use the mice carotid artery surgery to obtain mean arterial pressure (MAP); Use UV-visible spectrophotometer to detect content of NO in serum and measure NO and malonaldehyde (MDA)in the heart, livers, kidneys homogenated. Results:Compared with control group, the blood pressure of model group were increased significantly(P<0.01). Compared with model group, the treatment groups have different degree to reduce blood pressure. The blood pressure of combination group(H group) were close to control group. The contents of NO in serum, heart, liver and kidney of H group sharply increased(P<0.01), and MDA decreased(P<0.01). Conclusion:The combination group posed significant effect on the blood pressure, the contents of NO and MDA to protect the tissues from oxidative impairment, among which the mice in FG+B+L group were closer to normal level. And the effect is better than that of single use of FG group and metformin group.

L-NNA;RadixAconitiLateralis Preparata;Rhizoma Zingiberis;Metformin; Hypertension; NO; MDA

2014-09-04

張雅倩(1989-)，女，中國藥科大學(xué)碩士研究生，研究方向為心血管藥理。

王友群(1956-)，男，中國藥科大學(xué)副教授，研究方向為心血管藥理。

R285.5

A

1673-2197(2015)02-0008-03

10.11954/ytctyy.201502004