錢周敏

(溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟(jì)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

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低氧誘導(dǎo)神經(jīng)元特異性表達(dá)bFGF重組腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建研究

錢周敏

(溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟(jì)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

目的：研究構(gòu)建低氧誘導(dǎo)神經(jīng)元特異性表達(dá)堿性纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)重組腺相關(guān)病毒載體。方法：以堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)為治療靶基因，通過分子克隆手段，構(gòu)建低氧誘導(dǎo)、神經(jīng)元特異性表達(dá)bFGF的“時空”表達(dá)可調(diào)控性新型重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體。結(jié)果：將重組質(zhì)粒5HRE-3NRSE-bFGF的菌液送測序，得到測序結(jié)果，并與合成的DNA寡核苷酸序列進(jìn)行比較，證實與設(shè)計序列完全一致。結(jié)論：構(gòu)建、包裝重組腺相關(guān)病毒載體pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF有效。

青光眼；低氧誘導(dǎo)；神經(jīng)元特異性；腺相關(guān)病毒(AAV)載體

青光眼是人類的第二大致盲疾病，機(jī)械壓迫和缺血缺氧所致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡是該病致盲的主要原因。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)來源于中胚層和神經(jīng)外胚層多種類型細(xì)胞，在腦和視網(wǎng)膜的發(fā)育及神經(jīng)損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。導(dǎo)師長期從事生長因子與創(chuàng)傷修復(fù)的基礎(chǔ)理論、臨床應(yīng)用及其相關(guān)基因工程藥物方面研究，結(jié)果顯示bFGF具有神經(jīng)保護(hù)與促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突再生作用。bFGF為生物大分子，體外重組bFGF蛋白全身給藥難以透過血眼屏障發(fā)揮治療作用，若玻璃體腔內(nèi)局部給藥，由于半衰期短則需反復(fù)注射，易導(dǎo)致眼內(nèi)炎癥的發(fā)生，基因治療因可維持長時間的bFGF基因表達(dá)，是青光眼等慢性神經(jīng)變性疾病治療的理想選擇。

1 材料與方法

1.1 技術(shù)路線

本研究采用AAV Helper-Free System(Stratagene)構(gòu)建2型重組腺相關(guān)病毒載體，與傳統(tǒng)腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建方法比較，不存在輔助病毒的污染，并有效避免復(fù)制型腺相關(guān)病毒的產(chǎn)生，使用安全、高效。

①設(shè)計引物，分別以質(zhì)粒pCMV6-XL4/bFGF為模板，PCR擴(kuò)增目的基因bFGF；②通過基因重組手段，將bFGF插入質(zhì)粒pCMV-MCS多克隆位點(diǎn)EcoRI/HindIII之間，重組質(zhì)粒分別命名為pCMV-bFGF；③設(shè)計引物，以質(zhì)粒pShuttle-5HRE-3NRSE-Luc為模板，PCR擴(kuò)增基因表達(dá)調(diào)控序列5HRE-3NRSE；④設(shè)計引物，以pCMV-bFGF模板，PCR擴(kuò)增目的基因序列Intron-bFGF-polyA；⑤設(shè)計引物，將5HRE-3NRSE與Intron-bFGF-polyA配對，通過重疊PCR手段擴(kuò)增基因序列5HRE-3NRSE-Intron-bFGF-polyA；⑥所擴(kuò)增的基因序列5HRE-3NRSE-Intron-bFGF-polyA經(jīng)NotI酶切后，分別連接入質(zhì)粒pAAV-MCS，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF；⑦無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒中量制備所構(gòu)建的重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF，及重組腺相關(guān)病毒包裝質(zhì)粒pAAV-RC和輔助質(zhì)粒pHelper。見圖1。

圖1 重組腺病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建

1.2 材料

1.2.1 主要儀器 普通電冰箱(上海),高速冷凍離心機(jī)(Hitachi CR 2082，Japan),普通臺式高速離心機(jī)(上海),渦懸振蕩器(QL.866，海門市其林貝爾儀器制造有限公司),PCR擴(kuò)增儀(9600型，PE公司，U.S.A),水平離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY.IIl2型，北京六一儀器廠),細(xì)菌培養(yǎng)箱(PYX.DHS.35×40，上海醫(yī)療器械七廠),超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司)。

電子分析天秤(上海第二天平儀器制造廠),微量移液器(1000la l，20011 1，100μL，2-20la 1，0.5～10μL，Germany),普通槍頭(廣州威佳科技有限公司)。

1.2.2 菌株與質(zhì)粒 菌株為大腸桿菌DH5 a，溫州醫(yī)學(xué)院中試基地提供。

質(zhì)粒pENTR-D-TOPO-bFGF-IRES-hrGFP，由溫州醫(yī)學(xué)院中試基地提供,腺相關(guān)病毒所需的AAV Helper-Free System(Stratagene)由浙江省生物技術(shù)制藥工程重點(diǎn)實驗室提供。

1.2.3 主要試劑及試劑配制 75%乙醇(無水乙醇，國產(chǎn)分析純試劑),RT-PCR試劑盒(TaKaRaPrimeScriptTM RT-PCR Kit Cat：DRR014A),PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成),1×TBE電泳緩沖液,10×Loading buffer(0．25%溴酚蘭，0．25%-"甲苯青FF，40%蔗糖水溶液),DNA Marker(TaKaRa寶生物工程有限公司),DNA片段凝膠回收試劑盒(TaKaRa，DV805A)。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g加入800mL滅菌水，充分溶解，加NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，加滅菌水定容至1L，高壓滅菌后，40℃保存。

2 結(jié)果

酶切鑒定pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF：將菌種接種于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，搖菌過夜，次日提取質(zhì)粒，并純化。電泳結(jié)果，與預(yù)期結(jié)果一樣。見圖2。

圖2 pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF酶切鑒定——10000maker

3 討論

基因治療防治青光眼具有廣泛的應(yīng)用前景,但臨床應(yīng)用尚需進(jìn)一步研究。理想基因治療將遺傳物質(zhì)100%轉(zhuǎn)移，并定點(diǎn)整合到細(xì)胞基因組中，在細(xì)胞中長期、特異地表達(dá)并按特定要求受到控制,但目前基因轉(zhuǎn)移難以滿足要求。眼科應(yīng)用還要解決眼部的特異性及避免全身副作用等問題。探索理想基因轉(zhuǎn)移方法,解決基因轉(zhuǎn)移效率,提高基因表達(dá)水平及持續(xù)性,可成功轉(zhuǎn)移基因治療疾病。隨著基因治療基礎(chǔ)研究的發(fā)展, 基因治療必將應(yīng)用于眼科疾病,并為青光眼的治療提供全新手段。

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(責(zé)任編輯：李嵐春)

2014-11-24

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃創(chuàng)新項目(新苗人才計劃)“低氧誘導(dǎo)神經(jīng)元特異性表達(dá)bFGF重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建”(2012R413023)

錢周敏(1991-)，男，溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟(jì)學(xué)院在讀生，研究方向為中藥學(xué)。

R741

A

1673-2197(2015)06-0005-02

10.11954/ytctyy.201506002