于 良,馬菁纓，高 靜，劉學陽，紀紅蕊

(哈爾濱理工大學 化學與環(huán)境工程學院/綠色化工重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

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納豆激酶抗腦缺血作用及機制研究

于 良,馬菁纓，高 靜，劉學陽，紀紅蕊*

(哈爾濱理工大學 化學與環(huán)境工程學院/綠色化工重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：探討納豆激酶(NK)腦保護作用的具體機制。方法：通過制備大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)致缺血模型，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗、實時定量PCR實驗、紫外分光光度法研究納豆激酶對MCAO大鼠血小板內cAMP含量、對酪氨酸激酶1/信號轉導子和轉錄活化子1(JAK1/STAT1)通路表達、對腦組織SOD和MDA的影響；采用熒光分光光度法檢測了NK對凝血酶刺激后人刺激酶小板內鈣動員動脈阻塞血小板內鈣離子濃度變化。結果：NK顯著增加MCAO大鼠血小板內cAMP含量，同時激活損傷部位的JAK1/STAT1通路發(fā)揮抗細胞凋亡作用，顯著提升了腦組織SOD酶的活力、顯著降低了MDA的含量；在體外，抑制凝血酶誘導的血小板內鈣離子濃度的增加。結論：NK抗腦缺血作用的機制可能為以下幾點：升高環(huán)腺苷酸含量、抑制細胞內鈣釋放產生抗血小板活化作用；提高機體清除自由基的能力，降低脂質過氧化物的含量而抗自由基損傷；激活JAK1/STAT1通路產生抗凋亡作用。

納豆激酶；環(huán)腺苷酸；酪氨酸激酶/信號轉導子和轉錄活化子；自由基

血栓栓塞性疾病是目前全球死亡率占首位的病癥，嚴重危害中老年人生命和健康，且呈年輕化趨勢，其發(fā)病率和死亡率逐年上升[1]。近年來，抗血栓藥物的研究和開發(fā)受到廣泛關注，預防和治療血栓栓塞性疾病已經成為當前醫(yī)藥界亟待解決的問題。納豆激酶(nattokinase,NK)是具有溶解血栓的主要成分——纖維蛋白功能的一種絲氨酸蛋白酶，最初由日本學者須見洋行在納豆中發(fā)現并命名[2]。與傳統(tǒng)的抗血栓藥物相比，NK具有安全性高、成本低、生產工藝簡單、可口服、體內半衰期長等優(yōu)點，有望成為新一代溶栓藥物[3]。目前，NK的研究主要集中在高產菌株的篩選和發(fā)酵參數的優(yōu)化等方面，而其抗腦缺血發(fā)揮腦保護作用方面的研究少有報道，本研究分別從第二信使、細胞內鈣、自由基損傷、信號通路等幾方面探討NK對腦組織的保護作用，旨在為其合理應用提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康Wistar大鼠，雄性，體重250～300g，由哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.2 實驗試劑與藥品

納豆激酶膠囊(榮成百合生物技術有限公司)；蚓激酶腸溶片(長春遠大國奧制藥有限公司)；蛋白定量測試盒、SOD測定試劑盒、MDA測定試劑盒(南京建成科技有限公司)； cAMP試劑盒(美國Cayman chemical公司);fluo-3鈣離子染料(Invitrigen公司)，凝血酶(Thrombin)、Apyrase(BioLabs公司)；EGTA、Hepes(Amresco公司)。

1.3 實驗儀器

opticon2實時定量PCR儀(biorad公司)，T6紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，JY 92-IIN超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，TGL-18C高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，GF-F3000酶標儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司)，F-4500型熒光分光光度計(日本Hitachi公司)。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

將大鼠隨機分為假手術組、模型組、陽性藥蚓激酶組(0.4萬單位·d-1)、NK高劑量組(9.4mg·d-1)、NK低劑量組(4.7mg·d-1)組，藥物均溶解于生理鹽水中，給藥組動物分別于再灌注6h之內、24h、48h，經口給藥，末次給藥后4h內處死大鼠，取血，取腦；假手術組與模型組給予等量的生理鹽水，分別在再灌注24h處死大鼠，取血，取腦。

2.2 大鼠大腦中動脈阻塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)制備

Wistar大鼠水合氯醛(10%，0.35mg/kg)麻醉后，仰臥固定，分離右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸內動脈(interal carotid artery，ICA)及頸外動脈(exteral carotid artery，ECA)，結扎ECA與CCA，用動脈夾夾閉ICA遠心端后，迅速于距ECA與ICA分叉處約0.5cm的頸總動脈處作一切口，插入一端涂有石蠟的漁線(直徑為0.234mm)，插入深度為(18.5±0.5)mm，實現大腦中動脈阻塞導致腦缺血。結扎入口處，漁線外留約1cm，縫合皮膚。2h后輕輕提拉所留線頭至略有阻力以實現大腦中動脈再灌注。在缺血2h和再灌注時間內用電熱毯維持大鼠肛溫在36.5～37.5 ℃。假手術組大鼠分離頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，但只結扎CCA。

大鼠大腦中動脈阻塞形成缺血，2h后實現再灌注，模型穩(wěn)定24h后，處死大鼠，迅速取腦取血。

2.3 大鼠洗滌血小板制備

大鼠固定后，從其右側頸總動脈取血，檸檬酸鈉(3.8%，1∶9v/v)抗凝，800rpm離心20min，取上清得富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)，加入apyrase 1μL/mL，PRP 2 000rpm離心10min，沉淀用含0.35% BSA的Tyrode's buffer懸浮，然后用Tyrode's buffer洗滌2次，最后血小板用勻漿緩沖液重懸，得洗滌血小板(washed platelet，WP)，調整血小板計數為3.0×108/mL，置-80℃保存。

2.4 NK對MCAO大鼠腦組織SOD、MDA的影響

各不同處理組大鼠再灌注24h后，脫臼處死，取右腦大腦皮層組織，用冰冷的生理鹽水制備10%的腦組織勻漿，3 000r/min離心10min。上清液-20℃冷凍保存。按照試劑盒說明書分別在595nm 、532nm處，使用紫外分光光度計對腦組織SOD活力、MDA含量進行檢測。

2.5 ELLSA法檢測NK對MCAO大鼠洗滌血小板cAMP含量的變化

冰凍保存的WP用超聲破碎儀粉碎，30sec/mL，勻漿產物2 500rpm離心10min，取上清。上清適當稀釋后按照試劑盒說明用乙?；疎LISA法檢測cAMP含量。

2.6 Real-Time PCR法檢測NK對大鼠腦組織JAK1/STAT1表達的變化

使用Trizol法對腦組織RNA 進行提取，電泳檢查RNA的完整性，紫外分光光度儀測出每個樣品RNA的濃度后，用Rnase Free H2O稀釋至濃度為1μg/μL。引物序列見表1。然后進行反轉錄和定量PCR。反應條件為：95℃，10min；95℃，10s；60℃，10s；72℃，30s。共35cycles。制作擴增曲線、標準曲線、融解曲線，記錄數值，使用JAK1/STAT1均一化數值進行統(tǒng)計。

表1 引物設計及合成

2.7 熒光分光光度法檢測NK對Thrombin 誘導人血小板內鈣離子變化的影響

制備正常健康志愿者的PRP(含apyrase 1μL/mL)，PRP 2 000rpm離心10 min，得到的片狀沉淀用無鈣的Hepes buffer洗滌2次，重懸，得洗滌血小板(WP)，調整血小板計數為2×109/mL。加入BSA(終濃度為1.5g/L)，WP于37℃與fura-3/AM (5μmol/L，溶解于DMSO)孵育40min，然后懸浮于無鈣的Hepes buffer，終濃度為2×106platelets/mL。懸浮的WP分別進行如下處理，誘導組：WP與0.5U/mL的thrombin在37℃孵育4min；NK的25μg/mL,50μg/mL和100μg/mL劑量組分別先與WP在37℃孵育10min，再加入0.5U/mL的thrombin于37℃共同孵育4min。之后，不同處理組的WP離心、洗滌、重懸。使用F-4500型熒光分光光度計測量鈣離子的濃度，發(fā)射波長：506nm，分別記錄激發(fā)波長在400～800nm的數值。

按照下面公式(1)計算Ca含量，其中，[Ca2+]Free為游離鈣離子的濃度，Kd為Fluo-3Ca2+的有效解離常數，在生理條件下其值為325nmol/L；F、Fmax和Fmin均為λex=506nm、λem=460nm時測得的熒光強度；F為Fluo-3與細胞溫育后細胞懸液的熒光強度；Fmax為最大熒光強度,即細胞懸液在測定F值后，加入Triton X-100破壞細胞膜，使細胞內尚未與Ca2+結合的Fluo-3被Ca2+完全飽和所測得的熒光強度；Fmin為最小熒光值,即細胞懸液在測定Fmax值后，加入EGTA配合溶液中全部Ca2+，使Fluo-3呈游離狀態(tài)所測得的熒光強度。

公式(1)

懸浮于含鈣的Hepes buffer中的WP操作同上，同樣記錄其在激發(fā)波長400～800nm的數值，記錄[Ca2+]i。

2.8 實驗數據處理

實驗數據用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計處理，實驗結果采用單因素方差進行分析，以均值加減標準差表示，組間差異采用SNT方法比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 NK對MCAO鼠腦組織SOD、MDA的作用

由表2可以看出，經SPSS13.0軟件分析，與模型組比較，假手術組、NK高劑量組、LK組的SOD酶活力顯著增強(P<0.05)，而MDA含量顯著下降，且NK高劑量組和LK組無顯著性差異。

表2 NK 對MCAO鼠腦組織SOD 和MDA 的作用 (±s，n=5)

注:與模型組比較，*P<0.05。

3.2 NK對MCAO鼠洗滌血小板cAMP含量的影響

采用ELISA法檢測洗滌血小板內cAMP含量，經ANOVA分析，與模型組相比較，高劑量NK、低劑量NK均可使血小板內cAMP含量顯著升高。且高劑量NK組與LK組相比較無顯著性差異。

表3 NK對MCAO鼠血小板cAMP含量的影響 (±s，n=5)

注:與模型組比較，*P<0.05。

3.3 NK對MCAO大鼠腦組織JAK1、STAT1 PCR表達的影響

采用Real-Time PCR法分析了NK對缺血再灌注大鼠腦組織JAK1/STAT1的影響，其擴增曲線、標準曲線、融解曲線結果良好，使用JAK1/STAT1均一化數值進行統(tǒng)計，結果顯示，與模型組JAK1相比較，假手術組顯著下降，NK高劑量、中劑量、LK組均顯著升高，并且NK高劑量組與LK組無顯著性差異。與模型組STAT1相比較，假手術組顯著下降，NK高劑量顯著下降，見表4。

表4 NK對MCAO大鼠腦組織JAK、STAT1 PCR表達的影響 (±s，n=4)

注:與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 NK對人洗滌血小板Ca2+含量的影響

在血小板活化過程中，鈣離子動員起到了關鍵的作用，因此檢測了NK對Thrombin誘導人血小板內鈣離子變化的影響。在含鈣Hepes buffer中，與凝血酶誘導組鈣離子濃度相比，空白對照組顯著降低，NK高中劑量組預處理10min，顯著降低，見表5。此外，還檢測了無鈣Hepes buffer中NK對Thrombin 誘導大鼠血小板內鈣離子的變化，凝血酶誘導鈣離子濃度值與含鈣Hepes buffer中相比無顯著性差異(P>0.05)，比較NK對細胞外液中含Ca2+和不含Ca2+時[Ca2+]i的影響，結果無顯著差異(P>0.05)。

表5 在含鈣液中NK對人洗滌血小板Ca2+含量的影響 (±s，n=5)

注:與凝血酶誘導組比較，**P<0.01。

4 討論

SOD對于機體防御內、外環(huán)境中自由基損傷起著重要作用，是衡量自由基基礎代謝狀態(tài)的重要指標。MDA水平升高，SOD活性降低，即可引發(fā)氧化應激過程，會導致細胞受到損害甚至細胞死亡[4]。NK高劑量組中MDA含量顯著下降和SOD活力增強，說明NK能夠抗細胞損傷，防止氧化應激的發(fā)生。

有研究表明，蛋白酪氦酸激酶JAKl在哺乳動物大腦的發(fā)育和成熟階段能夠持續(xù)表達[5-6]。JAK-STAT通路的確對前腦的發(fā)育過程起到了重要作用[7]。本研究發(fā)現，假手術大鼠腦組織中JAKl、STATl均有發(fā)現，但缺血再灌注損傷后能進一步表達，模型組大鼠表達明顯高于假手術組，提示腦缺血再灌注損傷可誘發(fā)JAKl、STAT1的表達，它們的高表達，表明它們可能與腦缺血后神經細胞生存與凋亡的基因調控過程有關，目前主要認為JAKl和抗細胞凋亡有關，而STATl與誘導細胞凋亡有關。推測NK可能通過誘導JAKl mRNA高表達發(fā)揮其抗凋亡作用，通過降低STAT1mRNA表達而減輕其誘導神經元的凋亡作用，從而保護缺血神經元的損傷。

環(huán)核苷酸(cAMP)是重要的細胞內第二信使，血小板的活化往往伴隨著胞漿環(huán)核苷酸水平的降低，通過提升其內的環(huán)核苷酸水平可抑制血小板聚集[8]。實驗結果顯示NK高中劑量組均可以顯著提高血小板cAMP水平，從而達到抑制血小板聚集的作用。

綜上所述，通過體內體外研究，我們發(fā)現NK可以提升機體清除自由基的能力；可以激活大鼠大腦中動脈阻塞模型損傷部位的JAK1 mRNA的表達、抑制STAT1 mRNA的表達；可以直接通過升高大腦中動脈阻塞模型鼠血小板cAMP含量、抑制凝血酶誘導的血小板內鈣離子濃度的升高而發(fā)揮腦保護作用。

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(責任編輯：宋勇剛)

2015-06-02

黑龍江省大學生創(chuàng)新實驗項目(12521078)

于良(1994-),男，哈爾濱理工大學在讀生，研究方向為心血管藥理學、毒理學。

紀紅蕊(1978-)，女，哈爾濱理工大學博士研究生，研究方向為心血管藥理學、毒理學。E-mail：jihongrui720@126.com

R743.33

A

1673-2197(2015)21-0010-03

10.11954/ytctyy.201521004