孔桂菊，杜鴻志，袁勝濤，孫 立

(中國藥科大學(xué) 江蘇省新藥篩選中心，江蘇 南京 210009)

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金花茶正丁醇提取物對烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺癌作用研究

孔桂菊，杜鴻志，袁勝濤*，孫 立*

(中國藥科大學(xué) 江蘇省新藥篩選中心，江蘇 南京 210009)

目的：研究金花茶正丁醇提取物對烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺癌模型腫瘤發(fā)生的作用。方法：以烏拉坦(800mg/kg)每周2次，連續(xù)5周腹腔注射誘導(dǎo)小鼠肺癌模型，金花茶正丁醇提取物連續(xù)灌胃14周。檢測肺癌發(fā)生率，小鼠血清和肺組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、白細胞介素-2(IL-2)與腫瘤壞死因子(TNF-α)變化。結(jié)果：金花茶正丁醇提取物使烏拉坦誘導(dǎo)肺癌的發(fā)生率降為75.0%，模型組為90.5%；正丁醇組與模型組相比，血清中SOD、CAT、IL-2、TNF-α含量上升，組織中SOD、CAT含量顯著升高，血清與組織中MDA下降無顯著性差異。結(jié)論：金花茶正丁醇提取物對烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌有預(yù)防作用，主要機制可能與其抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

金花茶；烏拉坦；肺癌

金花茶是國家一級重點珍稀保護植物，被譽為“植物界的大熊貓”，現(xiàn)在已經(jīng)有很多人關(guān)注與研究金花茶的栽培育種，以使其發(fā)揮更好的觀賞價值與其他應(yīng)用價值。金花茶富含400多種對人體有益的營養(yǎng)及藥用成分，目前對金花茶抗腫瘤的研究正在進行中，很多報道表明[1-2]金花茶對體外前列腺癌、胃癌、鼻咽癌、食管鱗癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等細胞具有很好的生長抑制作用，其作用機制大多報道為誘導(dǎo)細胞凋亡。關(guān)于金花茶提取物對體內(nèi)腫瘤的抑制作用還未見報道，本文首次通過實驗驗證金花茶正丁醇提取物是否具有防癌效果，觀察金花茶正丁醇提取物對烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺癌的作用，并進一步探討金花茶正丁醇提取物防癌作用的機制，為金花茶“藥食兩用”的開發(fā)提供有力的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

昆明小鼠，雌性，體重18～22g，SPF級，購于上海杰思捷實驗動物有限公司，實驗動物許可證號SCXK(滬)2012-0006，實驗動物質(zhì)量合格證號0140158。

1.2 藥品與試劑

金花茶正丁醇部位由南京理工大學(xué)賈愛群教授實驗室提供；烏拉坦(Urethane，94300)購于瑞士Sigrna-alrich公司；超氧化物歧化酶(superoxde dismutas，SOD)測定試劑盒、過氧化氫酶(catalase，CAT)測定試劑盒及丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；白細胞介素-2(IL-2)及腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒購于上海裕臣生物科技有限公司。

2 方法

2.1 藥品與試劑配制

烏拉坦臨用前用生理鹽水配制，濃度為80mg/mL。金花茶正丁醇提取部位藥物用0.5%的CMCNa配置成10mg/mL。

2.2 模型建立與分組給藥

KM小鼠隨機分為3組，正常對照組、模型組、金花茶正丁醇提取物組(簡稱正丁醇組)分別有15、25、15只。模型組、正丁醇組小鼠腹腔注射烏拉坦800mg/kg，每周2次，連續(xù)5周，在造模的同時正丁醇組灌胃給予金花茶正丁醇提取物100mg/kg/d，連續(xù)14周，第15周實驗結(jié)束。

生：我是假設(shè)左邊三角形的底是a，右邊三角形的底是b，那么陰影部分的面積就是a×8÷2+b×8÷2，我們知道可以利用乘法分配律a×8÷2+b×8÷2=（a+b）×8÷2，而a+b=12，所以三角形的面積是12×8÷2=48（平方厘米）。

2.3 取材和觀察指標(biāo)

收集血樣及心、肝、脾、肺、腎、胸腺等內(nèi)臟。準(zhǔn)確稱取肝臟、脾臟、肺與胸腺的重量，計算臟器系數(shù)。記錄肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)。隨機選取每組4只小鼠的肺臟做HE染色。檢測血清與組織中SOD、CAT、MDA、IL-2及TNF-α。具體應(yīng)用方法參照試劑盒說明書。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 金花茶正丁醇提取物對肺癌小鼠體重的影響

對照組小鼠體重在第1、2、3周增長較快，4～14周穩(wěn)步增長。模型組、正丁醇組小鼠體重在造模并給予藥物的同時穩(wěn)步增長，在6～14周也無明顯差異。僅在第2、3、4周正丁醇組體重與對照組具有顯著性差異，結(jié)果見圖1。

圖1 金花茶正丁醇提取物對肺癌小鼠體重的影響

3.2 金花茶正丁醇提取物對肺癌小鼠臟器系數(shù)的影響

各組臟器經(jīng)過稱重發(fā)現(xiàn)，模型組與對照組相比脾臟重量降低且具有顯著性差異，其他各組間均無顯著性差異。各組的脾臟臟器系數(shù)為：模型組<正丁醇<對照組。表1中可以發(fā)現(xiàn)模型組與對照組相比，肝臟增大，脾臟減小，胸腺增大，肺增大；正丁醇組與對照比胸腺基本無變化，脾臟稍有減小，肝臟略減小，肺基本無變化。

表1 金花茶正丁醇提取物對肺癌小鼠臟器系數(shù)的影響 (±s)

注：***P<0.001。

對照組正常肺呈淡粉色，表面光滑，無突出物?；挤伟┬∈蠓尾空w呈淡粉色，上面有很多白色圓形結(jié)節(jié)點，略突出于肺表面。在第9、10、14周時取部分模型組小鼠解剖，查看肺腫瘤形成情況，肺結(jié)節(jié)在第9周已經(jīng)可見，第14周時可見較大的肺結(jié)節(jié)，見圖2。實驗結(jié)束，對照組無小鼠發(fā)生肺腫瘤，模型組肺腫瘤發(fā)生率為90.5%，金花茶正丁醇提取物組肺腫瘤發(fā)生率為75.0%。金花茶正丁醇提取物組左右肺平均結(jié)節(jié)數(shù)均小于模型組。

3.4 金花茶對肺組織HE染色的影響

實驗結(jié)束，每組選擇4只進行HE染色，結(jié)果為對照組正常肺組織由肺泡及肺內(nèi)支氣管組成，結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁輕度充血，無腫瘤細胞(見圖3對照組)。模型組4只小鼠肺內(nèi)出現(xiàn)腫瘤或腫瘤性增生病灶(出現(xiàn)率100%)。模型組腫瘤細胞體積大，略呈柱狀或多邊形，細胞核大、深染、核仁大而明顯，核分裂現(xiàn)象易見，肺柱狀其它部位中度出血(見圖3模型組)，還有2只出現(xiàn)炎細胞浸潤。正丁醇組中4只小鼠無腫瘤或腫瘤增生性病灶(出現(xiàn)率0%)，肺泡壁輕度充血、水腫(見圖3正丁醇組)，有輕度炎細胞浸潤，炎細胞類型主要為中性粒細胞和單核巨噬細胞。

表2 金花茶正丁醇提取物對小鼠肺腫瘤發(fā)生的影響 (±s)

3.5 金花茶正丁醇提取物對肺癌小鼠的生化指標(biāo)影響

在血清檢測中，模型組小鼠相對于正常對照組CAT、SOD、IL-2、TNF-α降低，MDA升高，無顯著性差異。正丁醇組相對于模型組，使烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺癌血清CAT、SOD、IL-2、TNF-α的含量升高，MDA含量下降，但無顯著性差異。在肺組織檢測中，模型組小鼠相對于正常對照組CAT、SOD含量降低，MDA含量升高，無顯著性差異。正丁醇組相對于模型組，使烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺癌組織CAT、SOD含量顯著升高，使MDA含量降低但無顯著性差異。

圖2 烏拉坦致肺癌變化情況

圖3 金花茶正丁醇提取物對烏拉坦致肺癌小鼠肺組織HE染色結(jié)果(HE，×200)

4 討論

小鼠肺癌模型建立的方法較多，烏拉坦是一種較好的致肺部腫瘤藥物[3]，采用昆明小鼠是因為其致癌比較敏感[4]，采用多次腹腔注射可以提高致癌率[5]，本實驗在給藥14周后已經(jīng)造模成功，模型組成瘤率為90.5%。小鼠體重在造模初期與對照組相比會有差異，但是整個造模過程體重變化與對照組基本一致，這與文獻報道烏拉坦不會影響小鼠體重相符[6]。我們誘導(dǎo)小鼠肺癌模型，研究金花茶正丁醇提取物對肺腫瘤發(fā)生的影響，發(fā)現(xiàn)金花茶正丁醇提取物可以降低腫瘤發(fā)生率，使腫瘤數(shù)目減少，表明金花茶正丁醇提取物具有預(yù)防腫瘤發(fā)生及抑制腫瘤生長的作用。通過HE染色證明模型組肺腫瘤形成，金花茶正丁醇提取物具有預(yù)防肺腫瘤作用。金花茶正丁醇提取物對肺癌的抑制率不是很高，可能是該提取物很難逆轉(zhuǎn)烏拉坦致肺癌的效果。另外金花茶正丁醇提取物可能對不同癌癥模型效果不同，研究表明金花茶正丁醇提取物對腸癌抑制效果很好，今后我們會多考慮不同藥物誘癌并增多癌癥模型進一步深入研究驗證金花茶的抗癌效果。

表3 金花茶正丁醇提取物對小鼠血清中MDA、SOD、CAT、IL-2、TNF-α含量的影響 (±s)

表4 金花茶正丁醇提取物對小鼠肺癌組織中MDA、SOD、CAT含量的影響 (±s)

注：*P<0.05 vs 模型組，***P<0.001 vs 模型組。

SOD、CAT屬于體內(nèi)消除自由基的酶類，它們與體內(nèi)其他抗氧化劑組成一個自由基的防御系統(tǒng)，以清除過多的自由基，防止自由基誘癌、促癌、致癌。MDA為反應(yīng)機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細胞的損傷程度及受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。文獻報道[7-10]金花茶提取物具有很好的抗氧化與清除自由基能力。本實驗結(jié)果顯示，金花茶正丁醇提取物使小鼠肺癌組織中SOD、CAT的含量顯著增加，使MDA含量降低，我們推測金花茶預(yù)防肺癌的效果與其抗氧化作用相關(guān)。

IL-2與反應(yīng)細胞的IL-2受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)TH、TC細胞增殖；激活B細胞產(chǎn)生抗體，活化巨噬細胞；增強NK細胞和淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞的活性，誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生[11]。干擾素具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。TNF-α主要由活化的單核/巨噬細胞產(chǎn)生，能殺傷和抑制腫瘤細胞，促進中性粒細胞吞噬。在本研究中金花茶提取物升高小鼠血清中的IL-2與TNF-α含量，但是效果不明顯。脾臟為免疫器官，模型組中脾臟減小而給藥金花茶正丁醇提取物后與對照組無差異。金花茶提取物的防癌抗癌作用是否與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)需要進一步驗證。

本文首次通過實驗驗證金花茶正丁醇提取物確實具有預(yù)防烏拉坦誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的作用，金花茶作為中藥預(yù)防腫瘤發(fā)生效果可觀，將其作為預(yù)防腫瘤的藥物開發(fā)具有深遠影響，我們今后將對其分子作用機制及對其他腫瘤的抑制效果進行深入研究，為開發(fā)藥物提供參考。

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(責(zé)任編輯：余 婷)

Study Effect of Extrative Fraction of Camellia chrysantha(Hu) Tuyama from n-butyl alcohol on Lung Carcinogenesis Induced by Urethane

Kong Guiju,Du Hongzhi，Yuan Shengtao*,Sun Li*

(Jiangsu Center for New Drug Screening,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)

Objective:To study the effect of extrative fraction from Camellia chrysantha Tuyama from n-butyl alcohol on lung carcinogenesis induced by urethane.Methods:The mouse lung carcinoma model was induced by intraperitioneal urethane 800 mg/kg twice a week for five weeks. The animals were treated with extrative fraction from Camellia chrysantha Tuyama from n-butyl alcohol for 14 weeks to investigate the rate of tumor incidence.The change of SOD,CAT,MDA,IL-2 and TNF-α in serum and in lung homogenate were tested.Results:Extrative fraction from Camellia chrysantha Tuyama from n-butyl alcohol could make urethane induced lung cancer incidence reduced to 75%,the model group was 90.5%;in N-butyl alcohol group compared with model group,the serum SOD,CAT,IL-2 and TNF-α levels rose,the content of SOD and CAT in lung homogenate increased significantly,the MDA in serum and tissue was down and there was no significant difference.Conclusion:Extrative fraction from Camellia chrysantha Tuyama from n-butyl alcohol can prevent lung carcinogenesis induced by urethane,which might be related to its antioxidantion and immune-regulation.

Camellia Chrysantha Tuyama;Urethane;Lung Cancer

2015-06-10

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃，2014AA022208)

孔桂菊(1990-)，女，中國藥科大學(xué)碩士研究生，研究方向為腫瘤藥理學(xué)。

通訊簡介：袁勝濤(1967-)，男，博士，中國藥科大學(xué)教授、博士生導(dǎo)師，研究方向為腫瘤藥理學(xué)；孫立(1976-)，女，博士，中國藥科大學(xué)副教授、碩士生導(dǎo)師，研究方向為腫瘤藥理學(xué)。

R285.5

A

1673-2197(2015)21-0004-03

10.11954/ytctyy.201521002