方秋華，肖田安，伍宏凱，胡苑玲

（廣東省獸藥飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，廣州510230）

高效液相色譜法測(cè)定飼料中艾司唑侖的含量

方秋華，肖田安?，伍宏凱，胡苑玲

（廣東省獸藥飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，廣州510230）

建立了高效液相色譜法測(cè)定預(yù)混合飼料、配合飼料和濃縮飼料中艾司唑侖含量的檢測(cè)方法。試樣用正己烷－二氯甲烷（1∶1，V／V）提取，經(jīng)MCX固相萃取柱進(jìn)一步凈化，采用反相高效液相色譜－紫外檢測(cè)法進(jìn)行定量分析。飼料中艾司唑侖的檢測(cè)限為0.1 mg／kg，定量限為0.25 mg／kg。在飼料中添加0.25、0.5、2.5 mg／kg水平的藥物回收試驗(yàn)中，平均回收率均在82.8%～105.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.62%～8.40%。該方法靈敏、準(zhǔn)確，適用于飼料中艾司唑侖含量的分析檢測(cè)。

艾司唑侖；飼料；高效液相色譜

艾司唑侖（又稱舒樂(lè)安定，Estazolam，EZL）屬苯二氮卓類抗焦慮鎮(zhèn)靜催眠藥，在人醫(yī)臨床中廣泛應(yīng)用于催眠、鎮(zhèn)靜、抗驚厥和抗精神失常。該類藥物能使動(dòng)物平靜，減輕機(jī)體對(duì)不良刺激的應(yīng)激，限制動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)，從而減少動(dòng)物維持體能的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，有益于增重。故有些不法分子在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下，可能在畜禽養(yǎng)殖中違規(guī)添加使用，以提高飼料轉(zhuǎn)化率。在飼料中濫用此類藥物將使其原型藥物和代謝產(chǎn)物不可避免地殘留于動(dòng)物源性食品中，導(dǎo)致畜產(chǎn)品品質(zhì)降低，人食用后會(huì)造成對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等的不良影響，危害身體健康。農(nóng)業(yè)部176號(hào)公告［1］禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用包括艾司唑侖在內(nèi)的精神類藥物。已有文獻(xiàn)報(bào)道用高效液相色譜法測(cè)定艾司唑侖的血藥濃度［2－8］，但前處理方法較簡(jiǎn)單，無(wú)法滿足基質(zhì)較為復(fù)雜的飼料樣品的測(cè)定要求，也有用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）測(cè)定動(dòng)物組織［9－11］、飼料［12－14］、血液［15－16］及尿液［17］中多種精神類藥物，但未有關(guān)于飼料中艾司唑侖的高效液相色譜檢測(cè)方法報(bào)道。本研究旨在建立一種高效液相色譜法測(cè)定飼料中艾司唑侖，以滿足對(duì)飼料非法添加的監(jiān)控要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 1260型液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；SUPELCOL Discovery C18色譜柱，美國(guó)Supelco公司；Mach 1.6 R冷凍型離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；MCX固相萃取柱，60 mg／3 mL，美國(guó)Waters公司；Millipore純水機(jī)。

艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自日本W(wǎng)AKO公司，乙腈、甲醇、甲酸，均為色譜純（德國(guó) CNW公司），正己烷、二氯甲烷、氨水、磷酸二氫鉀，均為分析純（廣州化學(xué)試劑廠），水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備 準(zhǔn)確稱取艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)品約50 mg，于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為1 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4℃保存，備用。

1.3 樣品提取與凈化 準(zhǔn)確稱取試料（2.0±0.02）g，于50 mL離心管中，加入水20 mL，用100 g／L碳酸鈉水溶液調(diào)pH至8.5～9.0，加入氯化鈉約1 g。準(zhǔn)確加入正己烷－二氯甲烷（1∶1，V／V）15 mL，中速振蕩10 min后，5000 r／min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入梨形瓶中。殘?jiān)儆?5 mL正己烷－二氯甲烷（1∶1，V／V）重復(fù)提取一次，合并提取液，在（35± 2）℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用甲醇5 mL分兩次溶解梨形瓶中的殘留物，備用。

MCX固相萃取柱用3 mL甲醇、3 mL水活化，取上述備用液過(guò)柱，用3 mL 2%甲酸水溶液、3 mL甲醇淋洗，用5%氨水甲醇溶液6 mL洗脫，收集洗脫液，45℃下氮?dú)獯蹈?，加? mL甲醇震蕩溶解殘?jiān)?，?.45 μm的濾膜濾過(guò)，濾液供液相色譜測(cè)定。

1.4 儀器測(cè)定 高效液相色譜系統(tǒng)。色譜柱為SUPELCOL Discovery C18柱（250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm），或相當(dāng)者；流動(dòng)相為乙腈（A），0.4%磷酸二氫鉀溶液（B）；梯度洗脫程序?yàn)椋?～10 min，44% A；10～11 min，44%A～75%A；11～15 min，75%A；15～17 min，75%A～44%A；17～20 min，44%A。流速1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)222 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30℃。

2 結(jié)果

2.1 光譜圖及色譜圖 在所確定的色譜條件下，艾司唑侖最大吸收波長(zhǎng)見(jiàn)光譜圖（圖1），艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖2，各空白飼料樣品添加艾司唑侖（0.5 mg／kg）所獲得的色譜圖見(jiàn)圖3～圖5。

圖1 艾司唑侖光譜圖

圖2 艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（1.0 μg／mL）

圖3 雞預(yù)混料空白添加艾司唑侖色譜圖（0.5 mg／kg）

圖4 雞配合料空白添加艾司唑侖色譜圖（0.5 mg／kg）

圖5 雞濃縮料空白添加艾司唑侖色譜圖（0.5 mg／kg）

2.2 線性范圍與檢出限 精密吸取艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)液（50 μg／mL）適量，用甲醇稀釋成濃度為0.20、0.50、1、2、5、10、20 μg／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，在所確定的色譜條件下，從低濃度到高濃度進(jìn)樣，每一濃度進(jìn)樣三針，將測(cè)得的峰面積的平均值（Y）與對(duì)應(yīng)濃度（X）擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)（表1）。

采用空白飼料添加低濃度標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3項(xiàng)方法進(jìn)行處理，然后上機(jī)檢測(cè)，以信噪比（S／N）≥3確定檢測(cè)限，以S／N≥10確定定量限。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 準(zhǔn)確度與精密度 對(duì)空白飼料分別以0.25、0.5、2.5 mg／kg艾司唑侖3個(gè)濃度水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度平行5份，同日測(cè)定，連續(xù)做3 d，結(jié)果見(jiàn)表2。艾司唑侖在各飼料樣品中的平均回收率在82.8%～105.9%之間，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.01%～7.78%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.62%～8.40%。

表1 艾司唑侖在各飼料中的線性方程、檢測(cè)限和定量限結(jié)果表

表2 艾司唑侖在各飼料樣品中的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果表

樣品類型 添加濃度／（mg·kg－1）回收率X（RSD）／% 1 2 3X（RSD）／%雞濃縮料0.25 91.2（3.47） 87.8（3.01） 87.2（1.52） 88.7（3.31）0.5 88.5（4.78） 88.2（6.13） 88.8（1.21） 88.5（4.21）2.5 82.8（3.77） 89.3（7.13） 83.8（3.61） 85.3（5.96）豬濃縮料0.25 91.6（1.38） 86.3（1.04） 87.9（1.40） 88.6（2.84）0.5 88.1（1.15） 90.6（1.29） 89.5（1.02） 89.4（1.62）2.5 93.5（1.89） 90.9（2.53） 90.3（1.56） 91.6（2.47）

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜條件的優(yōu)化 對(duì)于色譜柱的選擇，已報(bào)道的文獻(xiàn)資料表明精神類藥物在C18色譜柱上有較好的保留性質(zhì)，所以本研究利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的條件，主要比較了 SUPELCOL Discovery C18（150× 4.6 mm，5 μm）、Waters Sunfire C18（150×4.6 mm，5 μm）和SUPELCOL Discovery C18（250×4.6 mm，5 μm）這三種色譜柱。發(fā)現(xiàn)艾司唑侖在這三種色譜柱上均具有較好的保留性質(zhì)，但在Waters C18色譜柱上峰型較寬，在SUPELCOL Discovery C18（150 ×4.6 mm，5 μm）色譜柱上所得峰型雖好，出峰時(shí)間太早，容易受雜質(zhì)峰干擾，所以最后選用SUPELCOL Discovery C18（250×4.6 mm，5 μm）。

對(duì)于流動(dòng)相的優(yōu)化，本研究主要考察了甲醇或乙腈（有機(jī)相）與乙酸銨緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液（不同pH條件下）或超純水（水相）組成的流動(dòng)相體系對(duì)分析結(jié)果的影響。由0.4%KH2PO4（pH 4.5）、KH2PO4／K2HPO4（pH 5.8）、H3PO4／NaH2PO4（pH 6.4）等組成的磷酸鹽緩沖溶液、乙酸銨緩沖液（pH 6.84）與甲醇或乙腈組成的一定比例的流動(dòng)相體系中，能有效地將艾司唑侖與飼料中的其他組分分離。其中以乙腈－0.4%KH2PO4（pH 4.5）流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫時(shí)能有效地將藥物峰與雜質(zhì)峰分離，且得到最為優(yōu)異的峰型，對(duì)稱，不拖尾。

對(duì)于波長(zhǎng)的選擇，本研究在200～400 nm范圍內(nèi)對(duì)艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，在222、225、230、240、254 nm處有5個(gè)依次變低的吸收峰，最終選擇222 nm進(jìn)行測(cè)定。

3.2 樣品前處理方法的研究 對(duì)于苯二氮卓類藥物的殘留檢測(cè)，已報(bào)道的文獻(xiàn)常以乙酸乙酯、叔丁基甲醚、乙醚、乙腈、甲醇、正己烷、二氯甲烷、氯仿等為提取溶劑。本研究根據(jù)艾司唑侖的理化性質(zhì)并參考文獻(xiàn)主要考察了乙酸乙酯、乙腈、甲醇、正己烷、二氯甲烷等溶劑或其混合物的提取效果，發(fā)現(xiàn)以正己烷－二氯甲烷（1∶1，V／V）為提取溶劑時(shí)，提取回收效果最好，故以此為提取溶劑。目前對(duì)于苯二氮卓類藥物的凈化主要還是采用固相萃取法，主要考察了MCX、HLB、C18以及硅酸鎂小柱等實(shí)驗(yàn)室常用小柱的凈化效果，發(fā)現(xiàn)在相同條件下艾司唑侖在MCX小柱上具有最好的保留效果，回收率可達(dá)95%甚至更高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性也較好，而用其余三種小柱凈化后所得回收率不足10%，所以選擇MCX小柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理。

本文建立的HPLC－紫外檢測(cè)法，能快速檢測(cè)預(yù)混料、配合料和濃縮料中艾司唑侖含量。該方法前處理簡(jiǎn)便易行，靈敏度高，精密度好，回收率高，重復(fù)性好，可滿足飼料中艾司唑侖的分析要求。

［1］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第176號(hào).禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種［S］.

［2］郭勝才，鄒曉華，張玉榮，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定血漿中艾司唑侖、三唑侖和阿普唑侖濃度［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23（10）：599－601.

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［5］侯大平，張志國(guó)，國(guó)玉芝，等.HPLC法測(cè)定艾司唑侖血藥濃度的方法驗(yàn)證［J］.中國(guó)藥房，2011，22（14）：1280－1282.

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［7］葉美娣，滕 彥，汪東海.HPLC法測(cè)定地西泮和艾司唑侖的血藥濃度［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2000，17（1）：60－62.

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（編 輯：侯向輝）

Determination of Estazolam in Feeds by High Performance Liquid Chromatography

FANG Qiu－h(huán)ua，XIAO Tian－an?，WU Hong－kai，HU Yuan－ling
（Guangdong Institute for Veterinary Drugs and Feedstuffs Control，Guangzhou510230，China）

A confirmatory method has been developed and validated for the determination of estazolam（EZL）in premix，compound feed and concentrate feed using high performance liquid chromatography（HPLC）.The analyte was extracted from feeds using hexane－dichloromethane（1∶1，V／V），and then the sample extracts were purified by MCX solid－phase extraction.The analyte was analyzed by HPLC－UV.The limit of detection was 0.1 mg／kg for EZL，with quantification limit of 0.25 mg／kg.Recoveries were in the range of from 82.8%to 105.9%from feeds fortified at the 0.25，0.5，2.5 mg／kg levels，and the mean intra－laboratory reproducibility ranged from 1.62%to 8.40%.The developed method was sensitive and specific for the detection of estazolam in feeds.

estazolam；feeds；high performance liquid chromatography（HPLC）

2015－02－02

A

1002－1280（2015）04－0046－05

S859.83

2012農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定與修訂項(xiàng)目（168）

方秋華，碩士研究生，從事藥物殘留研究。

肖田安。E－mail：Xiaota＠hotmail.com