羅成江，陸春波，林仙軍，周志強，周芷錦，蔡文金，陳曉林，應永飛

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州311101）

氟喹諾酮類藥物粉劑中非法添加四種喹噁啉類藥物的UPLC檢測方法研究

羅成江，陸春波，林仙軍，周志強，周芷錦，蔡文金，陳曉林，應永飛?

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州311101）

建立了超高效液相色譜法測定氟喹諾酮類藥物粉劑中非法添加喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧及喹烯酮的方法。采用purospher RP－18色譜柱（2.1 mm×100 mm，粒徑2.0 μm）分離四種喹噁啉類藥物，以磷酸溶液和甲醇－乙腈（7.5∶7.0）為流動相進行梯度洗脫，流速0.3 mL／min，二極管陣列檢測器檢測，采集波長范圍為200～400 nm，分辨率為1.2 nm，記錄光譜圖和365 nm波長處的色譜圖。結(jié)果顯示，四種喹噁啉類藥物的濃度在0.2～100 μg／mL范圍內(nèi)的線性良好，相關(guān)系數(shù)r均為0.9999，回收率在98.0%～100.2%范圍內(nèi)，RSD在0.27%～0.89%之間，檢測限200 mg／kg。本方法快速、準確，可用于氟喹諾酮類粉劑中非法添加喹噁啉類藥物的定性和定量檢測。

氟喹諾酮類藥物；粉劑；喹噁啉類藥物；超高效液相色譜法

喹噁啉類藥物具有抗菌效果好、促生長、價格便宜等優(yōu)點，被廣泛用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中，但由于不正確使用，或者被一些不法分子違規(guī)使用，導致中毒事件時有發(fā)生。而且該類藥物在動物源性食品中殘留對人體具有潛在致癌性，同時還會誘導細菌產(chǎn)生耐藥性的可能，因此國際上大多數(shù)國家將其列為禁用、限用藥物［1］。另一方面，自20世紀60年代氟喹諾酮類抗菌藥問世以來，因其具有抗菌譜廣、殺菌力強、吸收快、體內(nèi)分布廣泛、不良反應小，與其他抗菌藥無交叉耐藥性等特點，被廣泛應用于治療動物各類感染［2］。近年來，一些不法分子在經(jīng)濟利益的驅(qū)使下，非法在氟喹諾酮類藥物制劑中非法添加喹噁啉類藥物，以達到更好藥效、更低成本且又更加隱蔽的目的。為了打擊氟喹諾酮類藥物制劑中非法添加喹噁啉類藥物的情況，我國制訂了氟喹諾酮類制劑中非法添加乙酰甲喹、喹乙醇等化學藥物檢查方法［3］，但此公告中僅涉及乙酰甲喹、喹乙醇的檢測，尚未對喹烯酮和卡巴氧進行檢測。因此建立一種準確、高效地同時測定氟喹諾酮類制劑中乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮和卡巴氧非法添加的檢測方法十分必要。本研究在參考了相關(guān)文獻［4］的基礎(chǔ)上，建立了UPLC法測定氟喹諾酮類藥物粉劑中非法添加喹噁啉類藥物的定性定量檢測方法。

1 材料

1.1 儀器 Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀－二極管陣列檢測器；AG－285電子天平（Mettler公司）；DELTA320 pH計（Mettler公司）；KQ－500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 對照品 乙酰甲喹、喹乙醇、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、卡巴氧、喹烯酮對照品均來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量大于99.0%；環(huán)丙沙星對照品來自中國食品藥品研究院，批號 130451－201203，含量84.2%。

1.2.2 試劑 磷酸，分析純，杭州高晶精細化工有限公司；三乙胺，分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司；乙腈、甲醇，色譜純，Merck KGaA公司；水，超純水。

1.2.3 供試品

1.2.3.1 陰性氟喹諾酮類粉劑 恩諾沙星可溶性粉，鹽酸環(huán)丙沙星可溶性粉，諾氟沙星粉，氧氟沙星可溶性粉均來自市售樣品，經(jīng)檢測均不含乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮、卡巴氧。

1.2.3.2 陽性添加氟喹諾酮類粉劑 在陰性氟喹諾酮類粉劑中分別添加乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮、卡巴氧對照品，混勻，根據(jù)喹噁啉類藥物添加達到一定藥效和市場臨床使用劑量，共添加3個含量，分別為0.5%、1.0%和2.5%。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 取喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧和喹烯酮對照品約25 mg，分別置50 mL量瓶中，加流動相A（磷酸3.0 mL加水1000 mL，用三乙胺調(diào)pH值至3.0，加乙腈50 mL，搖勻，即得）適量，超聲處理使溶解并稀釋至刻度，搖勻制成0.5 mg／mL的對照品儲備液。分別取恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星和環(huán)丙沙星對照品約25 mg置于50 mL量瓶中，加流動相A適量，超聲處理使溶解并稀釋至刻度，搖勻制成0.5 mg／mL的氟喹諾酮類藥物儲備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 分別稱取1.2.3.2項下的陽性添加樣品0.5 g于50 mL量瓶中，加流動相A適量，超聲處理使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.3 光譜數(shù)據(jù)庫溶液的制備 以喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧和喹烯酮對照品溶液（50 μg／mL）作為建立光譜數(shù)據(jù)庫的溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為Purospher RP－18（2.1 mm×100 mm，2.0 μm）；以磷酸溶液（磷酸3.0 mL加水1000 mL，用三乙胺調(diào)pH值至3.0，加乙腈50 mL，搖勻，即得）為流動相A；以甲醇：乙腈（7.5∶7.0）為流動相B，按表1進行梯度洗脫；采用二極管陣列檢測器，采集波長范圍為200～400 nm，分辨率為1.2 nm，柱溫30℃；記錄光譜圖和365 nm波長處的色譜圖。分別精密量取2.1.1項下的乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮和卡巴氧對照品儲備液1 mL，恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星和環(huán)丙沙星對照品儲備液10 mL，置于同一50 mL量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，為系統(tǒng)適用性試驗溶液，量取5 μL注入超高效液相色譜儀，記錄色譜圖。該條件下，按出峰時間先后順序依次是喹乙醇、乙酰甲喹、氧氟沙星、諾氟沙星、卡巴氧、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和喹烯酮，相鄰色譜峰的分離度符合要求，結(jié)果見表2，色譜圖和光譜圖分別見圖1、圖2。

表1 流動相組成和流速

表2 系統(tǒng)適用性試驗數(shù)據(jù)

圖1 系統(tǒng)適用性實驗色譜圖

2.3 峰純度和光譜相似度檢查 對供試品溶液色譜圖中四種喹噁啉類藥物色譜峰進行峰純度檢查以及對供試品溶液中喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧和喹烯酮的光譜圖與光譜庫進行匹配，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，各色譜峰的純度角度均小于純度閾值，此色譜條件下，四種喹噁啉類藥物的出峰位置無其他干擾峰，為單一物質(zhì)峰，方法可行；PDA匹配角度均小于匹配閾值，供試品溶液中相應色譜峰的光譜與喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧和喹烯酮光譜庫的光譜理想匹配，可認為是同一物質(zhì)。

圖2 4種喹噁啉類藥物的光譜圖

表3 峰純度檢查結(jié)果表

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取2.1.1項下4種喹噁啉類藥物標準儲備液，用流動相A稀釋成0.2、0.5、1、5、10、25、100 μg／mL的系列混合標準溶液，從低濃度到高濃度依次進樣，按上述色譜條件分析，以峰面積為縱坐標、標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表4。

表4 4種喹噁啉類藥物的線性結(jié)果表

2.5 添加回收試驗 按1.2.3.2項下陽性添加樣品，每個濃度做5份平行樣，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，進行儀器分析。按照外標法定量，回收率結(jié)果見表5。從回收率結(jié)果可以看出，本方法回收率為98.0%～100.4%，RSD在0.27%～0.89%之間。

2.6 檢測限 按2.1.1項下的4種喹噁啉類藥物儲備液制成混合標準溶液，進行梯度稀釋后添加到陰性對照氟喹諾酮類粉制劑中，按2.2項下的方法進行檢測，光譜未失真的最低添加含量作為檢測限，此時光譜圖和色譜圖分別見圖3、圖4。本方法的檢測限為200 mg／kg。

2.7 耐用性 從柱溫、流動相pH值、色譜柱三個方面考察色譜條件的耐用性。分別改變柱溫為25、30、35℃，流動相A的pH值2.8、3.0、3.2，色譜峰出峰順序無變化，保留時間稍有變化；使用不同品牌、不同型號的色譜柱，如MERCK Purospher RP－18（2.1 nm×100 mm，2.0 μm）；ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 nm×100 nm，1.7 μm）；ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 nm×100 nm，1.8 μm）等，結(jié)果八種成分仍能很好地分離且保留時間合理。在最佳實驗條件的選擇中流速的變化對八種成分的影響也不大，本方法建立的色譜條件耐用性較好。

表5 回收率試驗結(jié)果

圖3 4種喹噁啉類藥物的檢測限光譜圖

圖4 4種喹噁啉類藥物的檢測限色譜圖

2.8 專屬性試驗 取系統(tǒng)適用性實驗的混合標準溶液進行試驗，采用二極管陣列檢測器檢測，4種喹噁啉類藥物能夠很好的分離，4種氟喹諾酮類藥物均不干擾喹噁啉類藥物的檢測。

3 討論與分析

3.1 流動相的選擇 本實驗涉及4種氟喹諾酮類藥物與4種喹噁啉類藥物的有效分離。喹諾酮類藥物的母體結(jié)構(gòu)相同，理化性質(zhì)極為相似，因此僅選擇乙腈作為有機相不能完全分離［5］?？紤]到乙腈較甲醇的反相洗脫強度大，故在流動相中加入適量甲醇，以此來降低反相洗脫強度，達到分離選擇性微調(diào)的目的［6］。再對水相、乙腈和甲醇進行三因素三水平正交設(shè)計，最終確定流動相比例。在實現(xiàn)8種組分有效分離的情況下，采用等度洗脫，喹烯酮出峰時間過長，為了提高實驗效率，選擇了梯度洗脫。

3.2 色譜柱的選擇 因喹諾酮類藥物與喹噁啉類藥物理化性質(zhì)相近，實現(xiàn)完全分離的難度很大，本實驗采用C18柱，比較了不同品牌、不同規(guī)格色譜柱對分離效果的影響，結(jié)果表明均達到了較好的分離效果。采用填料粒徑較小的色譜柱，大大提高了分離效率，在本文建立的條件下，8種化合物實現(xiàn)了基線分離。

3.3 定性條件的優(yōu)化 方法采用二極管陣列檢測器進行測定，可以有效監(jiān)測喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧、喹烯酮是否受到其它物質(zhì)的干擾，同時利用二極管陣列檢測器的掃描功能，進行光譜相似度檢查鎖定非法添加藥物，大大提高了定性檢測的準確性。同時通過保留時間與對照品進行對比確認，實現(xiàn)了喹諾酮類藥物粉劑中非法添加喹噁啉類藥物的高效、快速、準確識別。

［1］劉發(fā)全，曾明華，許世富，等.同時測定飼料中乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮3種藥物方法的研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008，（24）：230－232.

［2］方忠意，班付國，周紅霞，等.氟苯尼考粉中非法添加四種喹諾酮類藥物的 HPLC檢測方法研究［J］.中國獸藥雜志，2013，47（3）：34－37.

［3］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1868號－氟喹諾酮類制劑中非法添加乙酰甲喹、喹乙醇等化學藥物檢查方法［S］.

［4］賈振民，吳寧鵬，宋志超，等.高效液相色譜法測定中獸藥制劑中喹噁啉類藥物［J］.中國獸藥雜志，2010，44（3）：13－15.

［5］于慧娟，畢世川.反相離子對液相色譜法同時測定11種氟喹諾酮類藥物的研究［J］.分析實驗室，2007，12（26）：23－26.

［6］劉自揚，董玲玲，范 強，等.HPLC－PDAD法檢測3種中獸藥散劑中違規(guī)添加4種喹諾酮類藥物的研究［J］.中國獸藥雜志，2014，48（4）：29－31.

（編 輯：李文平）

Determination of Four Kinds of Illegal Additives Quinoxalines in Quinolones Powder by UPLC

LUO Cheng－jiang，LU Chun－bo，LIN Xian－jun，ZHOU Zhi－qiang，ZHOU Zhi－jin，CAI Wen－jin，CHEN Xiao－lin，YING Yong－fei?
（Zhejiang Provincial Supervisory Institute of Veterinary Drug and Feedstuff，Hangzhou311101，China）

A method for the determination of olaquindox，maquindox，carbadox，quinocetone in quinolones powder by UPLC was developed.Purospher RP－18 column（2.1 mm×100 mm，2.0 μm）was used with the mobile phase consisted of phosphoric acid solution and methanol－acetonitrile（7.5∶7.0）.The flow rate was 0.3 mL／min；the column temperature was 30℃；the wavelength range was 200～400 nm.The result showed that the standard curves for four quinoxalines were in good linearity within a concentration range of 0.2～100 μg／mL（r＝0.9999），the recoveries for quinoxalines in quinolones powder ranged from 98.0%to 100.2%with theRSDfrom 0.27%to 0.89%.The limit of detection（LOD）was 200 mg／kg.The method was fast and accurate，and was suited for identification and determination of the quinoxalines in quinolones powder.

quinolones；powder；quinoxalines；UPLC

2015－02－02

A

1002－1280（2015）04－0024－06

S859.79

浙江省農(nóng)業(yè)廳中青年科技創(chuàng)新計劃項目（2013061）

羅成江，獸醫(yī)師，從事獸藥、畜產(chǎn)品安全檢測技術(shù)研究。

應永飛。E－mail：yyf1001＠163.com