潘 明，陳欲云，劉春麗，鄔亞平，代聯(lián)伶，陳利娟

(四川理工學(xué)院 a.生物工程學(xué)院;b.化學(xué)與制藥工程學(xué)院，四川 自貢 643000)

引言

仙茅(Curculigo orchioides Gaertn.)，又名地棕、獨(dú)茅、仙茅參等，為仙茅屬藥用植物;具有補(bǔ)腎助陽、益精血、強(qiáng)筋骨和行血消腫的作用。文獻(xiàn)［1］報(bào)道仙茅、大葉仙茅和三葉鬼針草已被傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)用于治療各種疾病，如陽痿、腰膝無力、胃腸道和心臟疾病。董國明［2］研究表明，仙茅提取物對(duì)陽虛型SD大鼠血清SOD、血清Zn/Cu比值、血漿cAMP/cGMP水平的恢復(fù)可能是仙茅壯陽作用的機(jī)制。Wu Xiuying［3］的研究表明仙茅苷可以降低老年大鼠腦AchE的活性，并下調(diào)BACE1的表達(dá)而改善老年大鼠記憶缺失的癥狀。

運(yùn)動(dòng)性疲勞亦稱體力性疲勞，在中醫(yī)學(xué)屬于“勞”、“虛勞”的范疇，即勞動(dòng)或運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致機(jī)體陽氣不足而引發(fā)肢軟乏力、神疲倦怠等氣虛癥候，形成體力性疲勞［4］。運(yùn)動(dòng)過程中，可因出汗津液損耗導(dǎo)致陰虛之癥;另一方面運(yùn)動(dòng)可致氣虛血瘀之癥;故人體能否迅速補(bǔ)充由于運(yùn)動(dòng)所消耗的精氣，排出運(yùn)動(dòng)過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，恢復(fù)機(jī)體陰陽平衡是機(jī)體抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的關(guān)鍵。

中國民間仙茅浸泡于酒中，制成仙茅酒用于治療陽痿滑精，腰膝冷痛，男子精寒，女子宮冷不孕，老年遺尿，小便余瀝等疾病。但尚未見仙茅酒抗疲勞作用的文獻(xiàn)報(bào)道，本研究對(duì)仙茅酒影響小鼠抗運(yùn)動(dòng)性疲勞作用機(jī)制做初步探討。

1 材料與儀器

1.1 材料

超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒，批號(hào):20131206;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒，批號(hào):20140317;肌糖原及肝糖原測(cè)定試劑盒，批號(hào):20140121;全血乳酸(LD)試劑盒，批號(hào):20140305;均購于南京建成生物工程研究所。仙茅，批號(hào):20131208，購于四川省中藥飲片有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠50只，雄性，購于中國醫(yī)學(xué)研究院四川省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(川)2013-15。

1.3 儀器

H-1850R臺(tái)式高速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;JJ-1電動(dòng)攪拌器，常州國華電器有限公司;756pc紫外可見分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 仙茅酒的制備

將仙茅200 g切成3 cm小段后浸泡于1000 mL小曲酒中，密封21天后過濾即得。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

SPF級(jí)ICR小鼠50只，正常飼養(yǎng)1周，開始實(shí)驗(yàn)。按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對(duì)照組、小曲酒組、仙茅酒低劑量、中劑量、高劑量5組，每組10只。給藥量參照《藥理與中藥藥理實(shí)驗(yàn)》［5］中推薦的成人服用中藥劑量折換成小鼠服用劑量，即空白對(duì)照組灌胃等劑量生理鹽水0.1 mL/10gBW，小曲酒組灌胃等劑量小曲酒0.1 mL/10gBW，仙茅酒低、中、高劑量組分別灌胃劑量為0.06 mL/10gBW、0.12 mL/10gBW、0.24 mL/10gBW，每天灌胃1次，連續(xù)14 d。

2.3 血清SOD、LDH測(cè)定

各組小鼠連續(xù)給藥14 d，參照《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法》［6］中抗疲勞作用檢驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。各組小鼠末次給藥30 min后，稱重，在小鼠尾根部負(fù)荷一塊質(zhì)量為小鼠體質(zhì)量10%的重物，將小鼠置于水溫25℃、水深25 cm的水箱中游泳3 min，然后將小鼠取出，5 min后摘眼球取血，收集于 2 mL離心管中，3500 r/min離心8 min，取上清即得血清。

血清SOD活力測(cè)定按照試劑盒說明書操作，血清中總SOD(T-SOD)活力計(jì)算公式:

血清LDH活力測(cè)定，乳酸脫氫酶催化乳酸生成丙酮酸的同時(shí)將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)還原成NADH。通過測(cè)定NADH在440 nm處吸光度可求得各樣本乳酸脫氫酶的活力。

2.4 全血乳酸(LD)含量測(cè)定

依照全血乳酸(LD)試劑盒說明書步驟操作，按2.3項(xiàng)小鼠摘眼球取血，留取50 μL全血，置于用肝素鈉處理過的離心管中，再加入0.6 mL蛋白沉淀劑，靜置10 min，3500 r/min 離心 8 min，取上清液 20 μL 加入酶工作液和顯色劑充分混勻，37℃孵育10 min，加入終止劑終止反應(yīng)。于530 nm波長處測(cè)定其吸光度值。

2.5 肝糖原和肌糖原含量測(cè)定

［7］濃硫酸可使得糖原脫水生成糖醛衍生物，后者再與蒽酮作用形成藍(lán)色化合物與同法處理的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液比色定量。各組小鼠取血后立即脫頸椎處死，解剖取出肝臟和后肢肌肉，置于冰凍生理鹽水中，剔除結(jié)締組織，用濾紙吸干，稱重(樣本質(zhì)量≤100 mg為宜)。按樣本質(zhì)量(mg):堿液體積(μL)=1:3配制濃減溶液，將樣本加入濃堿溶液中，沸水水浴20 min，流水冷卻后加入蒸餾水，按照試劑盒說明書操作，于620 nm波長處，測(cè)各樣本OD值。糖原含量的計(jì)算公式:

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，各組數(shù)據(jù)以±s表示。組間差異用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 小鼠一般情況變化

對(duì)小鼠一般情況觀察(表1)，用藥兩周后與空白對(duì)照組比較，仙茅低、中劑量組小鼠毛色、食欲正常，精神狀態(tài)好，體質(zhì)量無顯著性差異(P＞0.05);仙茅酒高劑量組小鼠體質(zhì)量顯著性增加(P＜0.05)，這可能是由于仙茅酒高劑量增加了小鼠食欲使得體質(zhì)量顯著性增加。

表1 各組小鼠體質(zhì)量

3.2 血清SOD的含量

小鼠血清中SOD的含量見表2，與空白對(duì)照組比較，仙茅酒高、中劑量組血清 SOD含量顯著升高(P＜0.05)，仙茅酒低劑量組有增加趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與小曲酒組比較，仙茅酒高、中劑量組血清SOD含量也顯著性升高(P ＜0.05)。

在勞累性運(yùn)動(dòng)中，SOD被認(rèn)為是抑制活性氧產(chǎn)生的抗氧化酶系中最先起作用的酶系之一［8］。另有研究報(bào)道［9］，血清中的SOD活性增加與運(yùn)動(dòng)性疲勞所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)加強(qiáng)有關(guān)系;SOD能夠增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)代謝廢物的清除能力，從而消除疲勞。連續(xù)給藥14 d后，仙茅酒中的活性成分顯著性地增加小鼠血清SOD含量，說明仙茅酒能增加小鼠體內(nèi)陰離子自由基的清除從而增加小鼠抗疲勞能力。

表2 仙茅酒對(duì)小鼠血清SOD含量的影響

3.3 血清LDH的活力

檢測(cè)小鼠血清中LDH含量，結(jié)果見表3。與空白對(duì)照組相比，仙茅酒組LDH活力均有提高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 仙茅酒對(duì)小鼠血清LDH活力的影響

LDH是一個(gè)能夠準(zhǔn)確反應(yīng)肌肉損傷程度的指標(biāo)，LDH可以催化乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，與乳酸的清除代謝相關(guān)，可減少乳酸的堆積［10］。由此可見，血清LDH活力是反映乳酸清除速度的指標(biāo)。連續(xù)給藥14 d后，負(fù)重游泳3 min，各組小鼠血清中LDH含量均有增高的趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可能延長仙茅酒干預(yù)時(shí)間，可以顯著性地提高小鼠血清LDH而加快乳酸清除速度。

3.4 全血LD的含量

小鼠全血LD含量檢測(cè)結(jié)果見表4，與空白對(duì)照組比較，仙茅酒高劑量組(P＜0.05)小鼠全血LD含量顯著性降低，小曲酒組、仙茅酒低、中劑量組小鼠全血LD含量有降低趨勢(shì)，但無顯著性差異(P ＞0.05);與小曲酒組比較，仙茅酒高劑組小鼠全血LD含量顯著性降低(P ＜0.05)，提示仙茅酒中的活性成分增加了小曲酒的抗疲勞作用。

表4 仙茅酒對(duì)小鼠全血乳酸含量的影響

Chang Qi［11］的研究表明，全血乳酸是一個(gè)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度指標(biāo)，電流刺激組的大鼠肌肉乳酸濃度低于運(yùn)動(dòng)對(duì)照組，提示肌肉乳酸濃度降低促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)大鼠有氧代謝過程中ATP的產(chǎn)生。肌乳酸是供能體系的中間產(chǎn)物，長時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)使機(jī)體相對(duì)缺氧，糖酵解加快，產(chǎn)生大量肌乳酸，這是導(dǎo)致疲勞的重要原因。運(yùn)動(dòng)過程中，肌肉產(chǎn)生的乳酸會(huì)在5～15 min內(nèi)滲入血液，使血乳酸含量上升，最終二者達(dá)到平衡，所以可以通過測(cè)定血乳酸含量反映肌乳酸情況［12］。本研究中各組小鼠連續(xù)給藥14 d，負(fù)重游泳3 min后，仙茅酒高劑量組可顯著性地降低小鼠全血中LD含量，從而提高小鼠抗疲勞的能力。

3.5 肝糖原及肌糖原的含量

小鼠肝糖原和肌糖原含量測(cè)定結(jié)果見表5，與空白對(duì)照組比較，仙茅酒高、中劑量組小鼠肌糖原含量明顯增高(P＜0.05)，仙茅酒高劑量組小鼠肝糖原含量也顯著性增高(P＜0.05);與小曲酒組比較，仙茅酒高劑量組小鼠肌糖原含量顯著性升高(P＜0.05)。

表5 仙茅酒對(duì)小鼠肝糖原與肌糖原的影響

在運(yùn)動(dòng)過程中，ATP的消耗和能源的不足是身體疲勞的關(guān)鍵因素，機(jī)體的能量供應(yīng)主要依賴于糖原發(fā)生糖酵解產(chǎn)生的ATP，所以糖原的儲(chǔ)備直接影響運(yùn)動(dòng)能力［13］。在中等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度過程中，疲勞主要是由于肌肉中的糖原耗盡［14］。文獻(xiàn)［15］報(bào)道，運(yùn)動(dòng)使得肌糖原不斷消耗，機(jī)體為維持血糖水平，將動(dòng)用肝糖原而導(dǎo)致肝糖原減少。在本研究中，仙茅酒可以通過增加肝糖原與肌糖原含量從而增加小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，減輕疲勞程度。

4 結(jié)束語

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，仙茅酒高劑量組(0.24 mL/10gBW)和中劑量組(0.12 mL/10gBW)可以提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，其機(jī)制可能與仙茅酒增加小鼠血清SOD含量從而加強(qiáng)機(jī)體清除運(yùn)動(dòng)過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的能力，間接地增強(qiáng)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力有關(guān);同時(shí)降低小鼠全血LD含量及升高小鼠肌糖原和肝糖原含量，為小鼠運(yùn)動(dòng)抗疲勞提供直接的能源。

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