★ 白黎明 白扇扇 崔小虎 張曉雙 (．陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腦病科 陜西 咸陽7000;．陜西中醫(yī)藥大學 陜西咸陽7046)

睡眠是恢復精力體力所必須的休息，睡眠剝奪(sleep deprivation)就是指各種原因所導致的睡眠減少或睡眠時間嚴重不足，是由于生理、病理因素或環(huán)境的影響而喪失了所需睡眠量的狀態(tài)，睡眠剝奪可導致機體認知功能的損害［1］。酸棗仁湯是由炒棗仁、茯苓、川芎、知母和甘草5味中藥組成，具有養(yǎng)心安神等功效。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明酸棗仁湯抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠和抗驚厥作用、廣泛地用于治療心悸、失眠等?。?］。本課題復制大鼠睡眠剝奪模型，考察酸棗仁湯對睡眠剝奪后大鼠學習記憶、病理學、海馬組織一氧化氮和一氧化氮合酶的影響。

1 材料與方法

1．1 動物 ♂SD大鼠，SPF級，體重(250±20)g。由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，實驗動物質(zhì)量許可證號:SCXK(陜)2007－001。

1．2 藥品及試劑 SZRT水煎劑(炒酸棗仁15g，茯苓6g，川芎6g，知母6g，炙甘草3g)的所有藥材均購自陜西省藥材公司，煎煮后濃縮至2．1g生藥/mL的藥液，分裝后置4℃冰箱保存?？捡R斯亮藍蛋白，NO，NOS測試盒，批號分別為20100108，20100113，20100113，均購于南京建成生物工程研究所。

1．3 器材 睡眠剝奪箱(自制);Y－迷宮(張家港市生物儀器廠)。KDC－160HR高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);DM4000B LED智能型生物顯微鏡(德國Leica);GB－204型電子天平(瑞士梅特勒有限公司)。

1．4 分組、造模［3］、給藥 ♂SD大鼠，隨機分為大平臺對照組(對照組)、睡眠剝奪組(模型組)、SZRT高、中、低劑量組(21，10．5，5．25g生藥/kg)。連續(xù)7d進行睡眠剝奪，在睡眠剝奪箱(90 cm×70 cm×50 cm)中放置10個小平臺(直徑6．5 cm，高8.0 cm)，平臺之間距離15cm，平臺周邊注滿水，水面距平臺面約1．0cm，大鼠在平臺上可飲食飲水，如果入睡就會落入水中，大鼠只能爬上平臺，這樣反復多次可達到睡眠剝奪的效果。對照組采用大平臺(直徑12cm，高8．0cm)作為對照，大鼠可以在大平臺上睡眠，入睡不會落入水中。對照組和模型組則灌服等體積的蒸餾水。SZRT高、中、低劑量組，造模期間每天ig SZRT水煎液，給藥體積l0mL/kg，連續(xù)給藥7d。

1．5 Y－maze［4］Y－maze主要應用于動物的辨別性學習，工作記憶及參考記憶的測試。它由一個中心區(qū)和其周圍連接的三條臂組成，每個臂的末端有發(fā)光源，發(fā)光臂為安全區(qū)，反之。先將大鼠放入迷宮中適應3～5min。采用隨機不休息法，安全區(qū)以無規(guī)則的次序變換開始時，對大白鼠所在支臂與另一支臂通電，動物在電擊下逃竄至燈光區(qū)后再保持l0s或30s為一次測試。然后動物所在支臂為下次測試的起始位置進行下一次測試。測試在第0d和7d進行?？疾熘笜?(1)錯誤反應次數(shù)(error number，EN):每個實驗日進行20次訓練測試，一個實驗日完成所有反應中錯誤反應的次數(shù)。(2)主動回避率(Active avoidance reaction ratio，AAR ratio):大鼠在燈亮后但未通電的5s內(nèi)完成逃避反應的次數(shù)占總反應次數(shù)的百分率。安全區(qū)燈亮，電刺激尚未開始時，大鼠即逃往安全區(qū)表明大鼠已經(jīng)形成了明暗辨別條件反射。

1．6 HE 每組取3只大鼠ip 10%水合氯醛3.0mL/kg麻醉，開胸暴露心臟，將穿刺針通過左心室進入升主動脈，剪開右心耳，先快速灌注37℃生理鹽水250mL，再緩慢灌注新鮮配置的4℃含4%多聚甲醛的0．1mol/L的磷酸緩沖250mL，斷頭剝離顱骨，完整取出大腦，投入到4%多聚甲醛中固定。制備石蠟切片。HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)形態(tài)學。

1．7 海馬NO含量和NOS活性 各組剩余大鼠斷頭取腦，取海馬，在4℃的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，加入冷生理鹽水，于勻漿管中充分研碎，制成10%的腦組織勻漿，3000 r/min離心15min取上清液，硝酸還原酶法測定NO含量，化學比色法測定NOS活性。

2 結(jié)果

2．1 Y－maze 結(jié)果見表1。由表1可見，造模前各組大鼠的EN和AAR ratio無顯著性差異(P＞0.05)。造模第7d，與對照組比較，模型組EN明顯增多，AAR ratio明顯減少(P＜0．01)，與模型組相比，SZRT高劑量組EN明顯減少(P＜0．05)。AAR ratio增多(P＜0．01)。

表1 各組大鼠Y－maze實驗結(jié)果(ˉx±s，n=10)

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)形態(tài)學(HE×200)

2．2 HE 結(jié)果見圖1。由圖1可見，對照組大鼠海馬CA1區(qū)可見緊密排列的錐體細胞。神經(jīng)細胞核仁、核膜清晰可見，胞漿染色正常;模型組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列紊亂，部分神經(jīng)元大小不一，呈三角形或不規(guī)則形，胞漿嗜酸性增強，核固縮;SZRT組和模型組相比，神經(jīng)細胞核固縮減少，神經(jīng)元變性程度減輕，海馬CA1區(qū)完整錐體細胞數(shù)明顯增多。2．3 NO含量和NOS活性 結(jié)果見表2。由表2可見，與對照組比較，模型組大鼠海馬中NO含量和NOS活性提高(P＜0．01);與模型組比較，SZRT高劑量組NO含量和NOS活性降低(P＜0．05)。

表2 各組大鼠海馬NO含量和NOS活性的影響(ˉx±s，n=10)

3 討論

隨著生活節(jié)奏的不斷加快和特殊部門工作的需要，睡眠剝奪是一種非常普遍的現(xiàn)象。睡眠可影響動物的行為和生理功能，如學習記憶和認知能力［5］。睡眠剝奪日益危害人類健康，也是導致人體亞健康主要原因之一。睡眠剝奪對機體可造成危害，臨床及動物試驗均表明睡眠剝奪可引起一系列綜合癥:如消瘦，能量消耗增多，血清兒茶酚胺類激素增多，體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的紊亂和激素水平的異常，機體免疫功能下降及條件性致病菌感染機會增加等。海馬區(qū)神經(jīng)元的變化是學習記憶功能改變的基礎(chǔ)。NO是一種自由基氣體，參與腦內(nèi)許多生理病理過程，如腦血流調(diào)節(jié)、學習記憶形成等［6］。睡眠剝奪后可導致機體NO的增多，而NO具有促進睡眠的作用，引起疲勞感和睡意。NO可通過第二信使環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)消除氧自由基，保護腦細胞，但過量的NO又可激活氧自由基，損害腦細胞［7］。隨著睡眠剝奪時間不斷增加，可使誘導型NOS激活，產(chǎn)生大量具有神經(jīng)毒性的NO。前期本課題組研究結(jié)果提示酸棗仁湯可改善睡眠剝奪大鼠學習記憶，可能與抑制神經(jīng)細胞的凋亡和改變單胺類遞質(zhì)的含量，保護膽堿能系統(tǒng)和抗氧化作用有關(guān)［8－9］。本次實驗的結(jié)果表明復方酸棗仁湯可提高睡眠剝奪后大鼠的學習記憶能力，可能與降低NO含量，抑制NOS活性有關(guān)。而具體機制還需要進一步探索。

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［8］張曉雙，，孫建寧，白黎明．酸棗仁湯對睡眠剝奪大鼠學習記憶的影響及機制研究［J］．中藥藥理與臨床，2014，30(4):8－11．

［9］張曉雙，白黎明，孫建寧．酸棗仁湯對睡眠剝奪模型大鼠學習記憶的影響［J］．中國藥房，2015，26(7):915－917．