呂夢(mèng)圓，呂永玲，夏 祥，林建國(guó)，王常高，蔡 俊，胡 瑛

（湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部生物工程學(xué)院，發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

大腸桿菌重組幾丁質(zhì)酶的表達(dá)、包涵體復(fù)性及酶學(xué)性質(zhì)研究

呂夢(mèng)圓，呂永玲，夏 祥，林建國(guó)，王常高，蔡 俊，胡 瑛*

（湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部生物工程學(xué)院，發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

通過(guò)研究重組幾丁質(zhì)酶在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)的濃度、時(shí)間和溫度，獲得表達(dá)的最佳條件。表達(dá)產(chǎn)物除了可溶性目的蛋白以外，仍存在于包涵體中。采用透析復(fù)性和Ni-NTA親和層析柱上復(fù)性?xún)煞N方法對(duì)包涵體中的目的蛋白進(jìn)行復(fù)性，并比較對(duì)目的蛋白產(chǎn)率和比酶活的影響。并考察了親和層析柱上復(fù)性時(shí)的上樣量、洗脫速率和溫度對(duì)酶活的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的幾丁質(zhì)酶可以采用透析和親和層析柱上復(fù)性，親和層析柱上復(fù)性的比酶活為1347.7 U/mg，明顯高于透析復(fù)性，但產(chǎn)率明顯低于透析復(fù)性。對(duì)1 mL的Ni-NTA親和層析柱，較低濃度的蛋白復(fù)性液在0.4 mL·min-1洗脫速率下，降低上樣量和溫度，可以提高復(fù)性效率。復(fù)性后的幾丁質(zhì)酶對(duì)熒光底物具有較高活性，反應(yīng)的最適溫度為37℃，最適pH為3.8。

幾丁質(zhì)酶，重組蛋白，包涵體，復(fù)性

幾丁質(zhì)（Chitin），又可稱(chēng)為甲殼素，廣泛存在于自然界中，主要來(lái)源于真菌類(lèi)的細(xì)胞壁、節(jié)肢動(dòng)物（蝦、蟹）的外骨骼、軟體動(dòng)物的器官和昆蟲(chóng)等[1]。估計(jì)每年自然界生物的生產(chǎn)量可達(dá)1×1011t[2]。幾丁質(zhì)能被幾丁質(zhì)酶降解產(chǎn)生幾丁二糖和幾丁寡糖，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)以及化妝品等行業(yè)具有獨(dú)特的使用價(jià)值[3]。幾丁質(zhì)酶（Chitinase，EC 3.2.1.14）是一類(lèi)能降解N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺β-1，4-糖苷鍵的酶。目前從多種微生物、植物及動(dòng)物中分離出多種幾丁質(zhì)酶[4]。目前為了獲得更有效更穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶，常利用現(xiàn)代生物技術(shù)增強(qiáng)幾丁質(zhì)酶的表達(dá)，但重組酶在大腸桿菌的表達(dá)中會(huì)形成包涵體。鑒于包涵體蛋白無(wú)活性及復(fù)性困難的缺點(diǎn)，目前采用較多的復(fù)性方法有稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、柱上復(fù)性、超濾復(fù)性等[5]。本文運(yùn)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)Lactococus lactis ssp. lactis IL1403菌株中的幾丁質(zhì)酶基因，優(yōu)化表達(dá)的最佳條件。采用透析復(fù)性和親和層析柱上復(fù)性?xún)煞N方法對(duì)包涵體中的目的蛋白進(jìn)行復(fù)性，并比較對(duì)目的蛋白的產(chǎn)率和比酶活的影響，并初步研究了幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

含Lactococus lactis ssp.lactis IL1403菌株幾丁質(zhì)酶的重組質(zhì)粒pETM11-LlChi18A 由加拿大Alberta大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室提供；E.coli BL21（DE3） Invitrogen公司；考馬氏亮藍(lán)G-250和4MU-（GlcNAc）3Sigma公司；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Takara公司產(chǎn)品；E.coli BL21（DE3） Invitrogen公司；Ni-NTA柱（3 cm×5 cm） 上海生工生物工程有限公司。

Y92-11型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；蛋白電泳儀 北京六一儀器；LS-45/55型熒光分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elme公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)表達(dá) 重組質(zhì)粒pETM11-LlChi18A采用化學(xué)法轉(zhuǎn)化到表達(dá)載體E.coli BL21 DE3中[9]。接種隔夜培養(yǎng)的E.coli到50 mL Luria-Bertani培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1卡那霉素），將過(guò)夜培養(yǎng)的重組E.coli按1%的接種量接入50 mL Luria-Bertani培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1卡那霉素），在37℃和250 r/min下培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6時(shí)，添加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）最終濃度為0.05 mmol·L-1，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h，并對(duì)誘導(dǎo)劑濃度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2 裂解菌體 將培養(yǎng)液4℃離心10 min（8，000 r/min）收集菌體，用PBS緩沖溶液（pH7.5）洗滌菌體。以十倍體積濃縮加入PBS，進(jìn)行超聲波破碎。功率40 W，超聲4 s，間歇6 s，超聲時(shí)間15 min。破碎后的菌液于4℃離心10 min（10，000 r/min），使包涵體沉淀與可溶性蛋白分離，分別收集沉淀與上清液。

1.2.3 重組蛋白純化及包涵體溶解 將上清液用Ni-NTA柱進(jìn)行親和層析純化，收集含有幾丁質(zhì)酶的流出液，用Amicon?Ultra-15 10 ku離心過(guò)濾器去除收集液中的咪唑并濃縮酶液，得到純化后的幾丁質(zhì)酶可溶性蛋白，將純化液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。將上述破碎沉淀加入2 mL變性溶解液（20 mmol·L-1Tris-HCl，pH=8.0，500 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1β-巰基乙醇，6 mol·L-1尿素，20 mmol·L-1咪唑），充分振蕩溶解，4℃過(guò)夜得包涵體溶解液。

1.2.4 包涵體的透析復(fù)性 將9倍體積的復(fù)性液（50 mmol·L-1KH2PO4，1 mmol·L-1EDTA，50 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1氧化型谷胱甘肽、1 mmol·L-1還原型谷胱甘肽，pH10.7）加入包涵體溶解液，室溫放置30 min，用KOH調(diào)pH至10.7；用HCl調(diào)pH至8.0室溫放置30 min，離心15 min（8 000 r/min），取上清用透析液（0.8 mol·L-1尿素，50 mmol·L-1KH2PO4，50 mmol·L-1NaCl）進(jìn)行透析，透析后用熒光法測(cè)酶活。

1.2.5 包涵體的親和層析柱上復(fù)性[10]及條件優(yōu)化 變性上樣緩沖液（20 mmol·L-1Tris-HCl，500 mmol·L-1NaCl，8 mol·L-1尿素，pH=8.0）平衡Ni-NTA柱，流速為0.5 mL·min-1。將2 mL包涵體溶解液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，上樣，流速為0.5 mL·min-1。以含20 mmol·L-1咪唑洗脫緩沖液洗柱，直至OD280不再變化，流速為0.5 mL·min-1。依次以含有5、4、3、2、1、0 mol·L-1尿素的復(fù)性緩沖液（20 mmol·L-1Tris-HCl，500 mmol·L-1NaCl，0.1 mmol·L-1氧化型谷胱甘肽，1 mmol·L-1還原型谷胱甘肽，pH8.0）洗柱，每個(gè)梯度10 mL，流速為0.2 mL·min-1。再以含有100 mmol·L-1咪唑的復(fù)性緩沖液洗脫，流速為0.5 mL·min-1，復(fù)性過(guò)程中OD值隨時(shí)間的變化，并收集各階段洗脫液，4℃離心10 min（10 000 r/min），取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。將不含尿素的洗脫液用熒光法測(cè)酶活。

1.2.5.1 蛋白上樣量對(duì)復(fù)性的影響 分別將50、100、150、200 mL培養(yǎng)液，在同樣條件下破碎離心后取沉淀，復(fù)性后用100 mmol·L-1咪唑的緩沖液進(jìn)行洗脫，用Bradford法測(cè)定復(fù)性后的蛋白溶液中蛋白質(zhì)的濃度，然后用熒光法測(cè)酶活。比較不同上樣量對(duì)蛋白比酶活的差異。三組平行，數(shù)據(jù)方差通過(guò)SPSS軟件計(jì)算。

1.2.5.2 溫度對(duì)復(fù)性的影響 取親和層析柱上復(fù)性后的重組蛋白，分別在4、25、35、45、55、65℃條件下保溫30 min，用熒光法測(cè)酶活，比較其蛋白比酶活的差異。三組平行，數(shù)據(jù)方差通過(guò)SPSS軟件計(jì)算。

1.2.5.3 尿素脫除速率對(duì)復(fù)性的影響 取變性蛋白溶液上樣，使復(fù)性液的流速分別為0.6、0.4、0.2、0.1 mL·min-1。柱上復(fù)性后用100 mmol·L-1咪唑的緩沖液進(jìn)行洗脫，用Bradford法測(cè)定復(fù)性后的蛋白溶液中蛋白質(zhì)的濃度，然后用熒光法測(cè)酶活。比較尿素脫除速度對(duì)復(fù)性的影響。三組平行，數(shù)據(jù)方差通過(guò)SPSS軟件計(jì)算。

1.2.6 重組幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.6.1 pH對(duì)酶活的影響 反應(yīng)體系：200 μmol·L-14-MU-（GlcNAc）3，2.0 nmol·L-1重組幾丁質(zhì)酶，2.0 mg·mL-1牛血清白蛋白和不同pH（3.0、3.4、3.8、4.2、4.6、5.0、6.0、7.0、8.0）的50 mmol·L-1檸檬酸-磷酸緩沖液。37℃下反應(yīng)20 min后添加1.95 mL Na2CO3（0.2 mol·L-1）試劑停止反應(yīng)。通過(guò)熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，三組平行，考察酶反應(yīng)的最適反應(yīng)pH，數(shù)據(jù)方差通過(guò)SPSS軟件計(jì)算。

1.2.6.2 溫度對(duì)酶活的影響 反應(yīng)體系：200 μmol·L-14-MU-（GlcNAc）3，2.0 nmol·L-1重組幾丁質(zhì)酶，2.0 mg·mL-1牛血清白蛋白和50 mmol·L-1檸檬酸-磷酸緩沖液。分別在不同溫度（28、31、34、37、40、43、46、49、52、55℃）下反應(yīng)20 min后添加1.95 mL Na2CO3（0.2 mol·L-1）試劑停止反應(yīng)。通過(guò)熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，三組平行，考察酶反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度，數(shù)據(jù)方差通過(guò)SPSS軟件計(jì)算。

1.2.6.3 金屬離子對(duì)酶活的影響 反應(yīng)體系：200 μmol·L-14-MU-（GlcNAc）3，2.0 nmol·L-1重組幾丁質(zhì)酶，2.0 mg·mL-1牛血清白蛋白和50 mmol·L-1檸檬酸-磷酸緩沖液。在基本反應(yīng)體系中分別加入1、5、10 mmol·L-1的CoCl2、KCl、MgCl2、CaCl2、LiCl、BaCl2、NiSO4、MnSO4、ZnCl2、CuSO4、NaCl、EDTA不同離子化合物。37℃下反應(yīng)20 min后添加1.95 mL Na2CO3（0.2 mol·L-1）試劑停止反應(yīng)。通過(guò)熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，三組平行，考察不同濃度下的不同金屬離子對(duì)酶活的影響，數(shù)據(jù)方差通過(guò)SPSS軟件計(jì)算。

1.2.7 測(cè)定方法

1.2.7.1 SDS-PAGE 采用垂直板狀電泳，SDSPAGE按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[6]。

1.2.7.2 Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度[7]以牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y=0.7537X-0.03812（R2=0.993；X為蛋白質(zhì)濃度，Y為吸光度）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和OD595吸光度值換算幾丁質(zhì)酶液的蛋白質(zhì)含量。

1.2.7.3 幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)[8]以熒光物質(zhì)4-甲基傘形酮（4-MU）為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用熒光分光光度計(jì)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y=0.6398X+2.4484（R2=0.991；X為4-MU濃度，Y為熒光值）。以不同濃度的4-MU-（GlcNAc）3為底物，反應(yīng)液還包含2.0 nmol·L-1幾丁質(zhì)酶，2.0 mg·mL-1牛血清白蛋白和200 μL 50 mmol·L-1檸檬酸-磷酸緩沖液。37℃下反應(yīng)不同時(shí)間，取50 μL樣液，加入1.95 mL Na2CO3（0.2 mol·L-1）停止反應(yīng)，采用熒光分光光度計(jì)（激發(fā)波長(zhǎng)380 nm、發(fā)射波長(zhǎng)460 nm）測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算酶活和比酶活，3次平行的結(jié)果取平均值。1個(gè)酶活力單位是指在37℃下，每分鐘釋放1 μmol熒光物質(zhì)的酶量，而比酶活為1 mg幾丁質(zhì)酶所具有的酶活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組幾丁質(zhì)酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 誘導(dǎo)劑濃度的確定 從圖1中可以看出，IPTG添加終濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1 mmol·L-1下培養(yǎng)12 h后，在相同菌體量的情況下，所得目的蛋白的含量差異。通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)換算知，0 mmol·L-1時(shí)菌體的OD600=5.943，0.01 mmol·L-1時(shí)菌體的OD600= 6.150，0.05 mmol·L-1時(shí)菌體的OD600=5.886，0.1 mmol·L-1時(shí)菌體的OD600=5.967，0.5 mmol·L-1時(shí)菌體的OD600= 5.466，1 mmol·L-1時(shí)菌體的OD600=5.766。當(dāng)誘導(dǎo)劑最終濃度為0.05 mmol·L-1（S3）時(shí)，所獲得目的蛋白的含量達(dá)到最高，且在相同的培養(yǎng)時(shí)間下大腸桿菌生長(zhǎng)不受IPTG的影響，菌體量大致一樣。因此選取最適IPTG添加終濃度為0.05mmol·L-1。

圖1 IPTG濃度對(duì)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的影響Fig.1 The effect of concentration of IPTG on expression of recombinant induced by IPTG

2.1.2 誘導(dǎo)溫度的確定 從圖2中可以看出，表達(dá)的蛋白當(dāng)誘導(dǎo)溫度在25℃以下時(shí)重組蛋白的可溶性表達(dá)量較高。這說(shuō)明在較低的溫度下，該重組菌的菌體生長(zhǎng)速度和重組蛋白的表達(dá)速度都會(huì)變低，使得表達(dá)重組蛋白慢慢的可溶，減少包涵體的形成。所以25℃是重組蛋白的最適表達(dá)溫度。

圖2 溫度對(duì)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的影響Fig.2 The effect of temperature on expression of recombinant induced by IPTG

2.1.3 誘導(dǎo)時(shí)間的確定 從圖3中可以看出，IPTG添加終濃度為0.05 mmol·L-1下培養(yǎng)3、6、9、12、24 h后，在相同菌體量的情況下，所得目的蛋白的含量差異并不是很明顯。但隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，OD600明顯增加。因此，最適培養(yǎng)時(shí)間為12 h，此時(shí)菌體量已達(dá)到需求且對(duì)于超聲破碎效率較高。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的影響Fig.3 The effect of culture time on expression of recombinant induced by IPTG

2.2 重組幾丁質(zhì)酶的分離純化

表達(dá)后的幾丁質(zhì)酶蛋白經(jīng)超聲破碎和Ni-NTA柱親和層析純化后在SDS-PAGE上呈現(xiàn)一條譜帶，純度較高，相對(duì)分子質(zhì)量約為54 ku。從圖4中還可以看出，重組大腸桿菌表達(dá)的幾丁質(zhì)酶經(jīng)細(xì)胞破碎后，存在于上清液中，還有一部分以包涵體的形式存在于沉淀中，但包涵體形式的幾丁質(zhì)酶不具有酶活。通過(guò)前期優(yōu)化產(chǎn)酶條件，在IPTG濃度為0.05 mmol·L-1，溫度25℃培養(yǎng)12h，可使上清液中目的基因的量增加，而包涵體中的含量相對(duì)減少，但并不能完全消除包涵體的形成。

圖4 甲殼素酶分離純化SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE analysis of chitinase purification

2.3 透析復(fù)性與親和層析柱上復(fù)性

通過(guò)透析復(fù)性與親和層析柱上復(fù)性對(duì)包涵體進(jìn)行處理后，得到具有酶活的重組幾丁質(zhì)酶。從圖5中，可以看出透析復(fù)性的蛋白質(zhì)含量比親和層析的高，但在蛋白純度上，親和層析比透析復(fù)性有優(yōu)勢(shì)，通過(guò)表1中的數(shù)據(jù)可以看出，親和層析柱上復(fù)性所得的幾丁質(zhì)酶的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于透析復(fù)性所得。

圖5 透析復(fù)性與親和層析柱上復(fù)性的SDS-PAGE比較Fig.5 Compared with two kinds of refolding method by SDS-PAGE

表1 透析復(fù)性與親和層析柱上復(fù)性的比酶活和蛋白含量的比較Table 1 Compared with two kinds of refolding methods by specific activity and content of protein

2.4 親和層析柱上復(fù)性影響酶活的因素

2.4.1 溫度對(duì)復(fù)性的影響 將純化后的復(fù)性蛋白，分別在4、25、35、45、55、65℃條件下保溫30 min，用熒光法測(cè)定其酶活。由圖6可以看出，復(fù)性后的幾丁質(zhì)酶在4～35℃溫度范圍內(nèi)活性較為穩(wěn)定，溫度高于35℃后，其穩(wěn)定性開(kāi)始急劇下降，溫度為65℃時(shí)酶活幾乎降為0，因此幾丁質(zhì)酶包涵體在4℃下復(fù)性處理較為合理。

圖6 復(fù)性幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性（p＜0.05）Fig.6 Thermal stability of refolded chitinase（p＜0.05）

2.4.2 蛋白上樣量對(duì)復(fù)性的影響 從圖7中可以看出，隨著上樣量的增加，其復(fù)性效率會(huì)逐漸降低。增加上樣量后不僅不能提高目的蛋白的濃度和活性，還會(huì)增加雜蛋白的濃度。這主要是因?yàn)槲皆阪囍系牡鞍?，在?fù)性過(guò)程中分子間會(huì)形成聚集體，且隨著蛋白濃度的增加，其形成聚集體的機(jī)會(huì)增大，因此復(fù)性效率會(huì)降低。由此可知，親和層析柱上復(fù)性只能進(jìn)行小劑量的實(shí)驗(yàn)分析。

圖7 蛋白上樣量對(duì)復(fù)性幾丁質(zhì)酶比酶活的影響（p＜0.05）Fig.7 The effect of loading amount of protein on the specific activity of refolded chitinase（p＜0.05）

2.4.3 尿素脫除速率對(duì)復(fù)性的影響 從圖8中可以看出，尿素復(fù)性液的線(xiàn)性梯度形成時(shí)的溶液流速對(duì)復(fù)性酶活的影響。當(dāng)其速率為0.1～0.4 mL·min-1時(shí)，復(fù)性的包涵體酶活隨著洗脫速率的增加而提高，但當(dāng)洗脫速率增加到0.6 mL·min-1時(shí)，酶活下降。由于尿素的線(xiàn)性變化是一定的，因此流速越快，尿素的脫除速度也越快。尿素是蛋白變性劑，其脫除速度慢，蛋白復(fù)性過(guò)程長(zhǎng)，可反復(fù)進(jìn)行折疊和變性，復(fù)性效率就高；相反，尿素脫除速度快，蛋白很難進(jìn)行反復(fù)折疊，復(fù)性效率就低。

圖8 尿素脫除速率對(duì)復(fù)性幾丁質(zhì)酶比酶活的影響（p＜0.05）Fig.8 The effect of urea elution rate on the specific activity of refolded chitinase（p＜0.05）

2.5 重組幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 pH及溫度對(duì)重組蛋白酶活的影響 通過(guò)熒光底物4-MU-（GlcNAc）3測(cè)定重組幾丁質(zhì)酶在不同pH的緩沖液體系中的酶活力，結(jié)果如圖9（A）所示，說(shuō)明幾丁質(zhì)酶在pH3.0～3.8時(shí)，熒光強(qiáng)度逐漸增加，說(shuō)明酶降解底物釋放出更多的（GlcNAc）2，隨著pH的繼續(xù)增加，熒光強(qiáng)度逐漸下降，說(shuō)明隨著pH的增加，酶的活性逐漸下降，當(dāng)pH為8時(shí)酶的活性幾乎為零。通過(guò)熒光底物4-MU-（GlcNAc）3測(cè)定重組幾丁質(zhì)酶LlChi18A在不同溫度下的酶活力，結(jié)果如圖9（B）所示。當(dāng)反應(yīng)溫度在28～37℃之間，酶活力呈上升的趨勢(shì)，37℃為酶反應(yīng)最佳溫度，這可能是由于該酶來(lái)源于Lactococcus lactis ssp.lactis IL1403，其最適生長(zhǎng)溫度為37℃。當(dāng)反應(yīng)溫度在37℃以上時(shí)，酶活力逐漸下降，溫度的升高改變了酶的空間結(jié)構(gòu)以至于酶失去活性。

圖9 pH（A）和溫度（B）與對(duì)重組幾丁質(zhì)酶酶活的影響（p＜0.05）Fig.9 The Effect of pH（A）and temperature（B）on the activity of recombinant chitinase（p＜0.05）

2.5.2 金屬離子對(duì)酶活的影響 從表2中可以看出，金屬離子Co2＋、K＋、Mg2＋、Ca2＋、Li＋、Ba2＋、Ni2＋、Mn2＋、Zn2＋、Cu2＋、Na＋和EDTA，當(dāng)在反應(yīng)混合物的最終濃度為1、5或10 mmol·L-1時(shí)，金屬離子對(duì)重組幾丁質(zhì)酶酶活的影響。當(dāng)濃度為10 mmol·L-1時(shí)，金屬離子Zn2＋、Cu2＋、Co2＋和Mn2＋強(qiáng)烈抑制幾丁質(zhì)酶的活性。同時(shí)，Cu2＋、Ni2＋的濃度在5和10 mmol·L-1時(shí)強(qiáng)烈抑制幾丁質(zhì)酶的活性。隨濃度的增加，EDTA對(duì)幾丁質(zhì)酶的活性呈負(fù)效應(yīng)；1 mmol·L-1Na＋、Mg2＋和5 mmol·L-1Ba2＋、Li＋對(duì)幾丁質(zhì)酶的活性有促進(jìn)作用。其他金屬離子（Ca2＋、K＋）對(duì)酶活性的影響的較弱。

表2 不同金屬離子在不同濃度下對(duì)重組蛋白相對(duì)酶活的影響（p＜0.05）Table 2 The effect of various metal ions on the relative activity of recombinant chitinase（p＜0.05）

3 結(jié)論

幾丁質(zhì)酶在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，可溶性蛋白和包涵體均有表達(dá)。經(jīng)含有8 mol·L-1尿素的溶解緩沖液處理后，包涵體變性溶解。通過(guò)比較透析復(fù)性法和親和層析柱上復(fù)性法對(duì)包涵體復(fù)性產(chǎn)率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，親和層析柱上復(fù)性在酶活上明顯優(yōu)于透析復(fù)性，但產(chǎn)率上透析復(fù)性要明顯高于親和層析柱上復(fù)性。通過(guò)優(yōu)化親和層析柱上復(fù)性的條件，結(jié)果表明，較低濃度的蛋白復(fù)性液在0.4 mL·min-1洗脫速率下，降低上樣量并降低環(huán)境溫度，能有效提高復(fù)性效率。親和層析柱上復(fù)性得到高純度、可溶的重組幾丁質(zhì)酶蛋白的最適pH為3.8，最適溫度為37℃。當(dāng)濃度為10 mmol·L-1時(shí)，金屬離子Zn2＋、Cu2＋、Co2＋和Mn2＋強(qiáng)烈抑制幾丁質(zhì)酶的活性。同時(shí)，Ni2＋的濃度在5和10 mmol·L-1時(shí)強(qiáng)烈抑制幾丁質(zhì)酶的活性；隨濃度的增加，EDTA對(duì)幾丁質(zhì)酶的活性呈負(fù)效應(yīng)；1 mmol·L-1Na＋、Mg2＋和5 mmol·L-1Ba2＋、Li＋對(duì)幾丁質(zhì)酶的活性有促進(jìn)作用。其他金屬離子（Ca2＋、K＋）對(duì)酶活性的影響的較弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Expression and inclusion body renaturation of recombinant chitinase in E.coli and its enzymology properties

LV Meng-yuan，LV Yong-ling，XIA Xiang，LIN Jian-guo，WANG Chang-gao，CAI Jun，HU Ying*
（Department of Bioengineering，Hubei University of Technology，Key Laboratory of Fermentation Engineering（Ministry of Education）/Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation，Wuhan 430068，China）

This study aimed to use E.Coli BL21（DE3）to overexpress recombinant chitinase and study the concentration of inducer，time and temperature of expression to optimize the expression.The recombinant chitinase was not only in the soluble protein but also in the inclusion body.The refolding methods by dialysis and Ni-NTA column were used to renature the chitinase and were compared by the content of protein and specific enzyme activity.The effects of the loading protein amount，the flow rate of refolding buffer and the temperature on the refolded chitinase were investigated.The results show that chitinase could be refolded by dialysis and Ni-NTA column.The enzyme activity of chitinase by the affinity chromatography which was 1347.7 U/mg was higher than by the dialysis method，but its yield by the affinity chromatography was lower than by the dialysis method.The enzyme activity of refloding increased when the chitinase sample with lower concentration was loaded to the column under lower temperture at the optimal elution rate of 0.4 mL·min-1.The chitinase from the affinity chromatography refolding possessed higher activities to degrade fluorescent substrate. The optimal temperature was 37℃and the optimal pH value was 3.8.

chitinase；recombinant protein；inclusion body；refold

TS201.2

A

1002-0306（2015）22-0168-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.027

2015－04－14

呂夢(mèng)圓（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：生物可再生資源的微生物利用，E-mail：lvmengyuan315@163.com。

*通訊作者：胡瑛（1975-），女，副教授，研究方向：再生資源生物利用和生物活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，E-mail：huying@mail.hbut.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201425）。