崔丹　李志惠　趙杰　馮秀莉　劉朋沖　任欣欣　楊永輝

胸水酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測在結(jié)核性胸膜炎中的診斷價(jià)值

崔丹李志惠趙杰馮秀莉劉朋沖任欣欣楊永輝

【摘要】目的探討胸水酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(ELISPOT)在結(jié)核性胸膜炎中的診斷價(jià)值。方法應(yīng)用ELISPOT試驗(yàn)檢測結(jié)核性胸膜炎60例和對照組39例胸腔積液中的γ干擾素水平，同時(shí)對試驗(yàn)標(biāo)本進(jìn)行涂片、培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測TB-DNA及腺苷脫氨酶(ADA)。結(jié)果結(jié)核性胸膜炎患者胸水ELISPOT檢測敏感性為91.7%特異性為84.6%，抗酸染色涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)、TB-DNA和ADA的敏感性分別為18.3%，21.7%，36.7%和88.3%。結(jié)論ELISPOT方法檢測胸腔積液γ干擾素可作為結(jié)核性胸膜炎的可靠指標(biāo)，其敏感性高于臨床常規(guī)檢測方法。

【關(guān)鍵詞】胸水酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測;γ干擾素;結(jié)核性胸膜炎

作者單位: 050041石家莊市，河北省胸科醫(yī)院結(jié)核一科

E-mail: shuiqing_2001@ sina.com

結(jié)核性胸膜炎是由結(jié)核分枝桿菌及其代謝產(chǎn)物引起的胸膜炎癥，結(jié)核桿菌及其代謝產(chǎn)物進(jìn)入高敏狀態(tài)的人體胸腔中，引發(fā)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，致使胸膜通透性增加，產(chǎn)生胸腔積液。近年來結(jié)核性胸膜炎的發(fā)病成上升趨勢［1］，其診斷主要依靠臨床診斷。目前診斷結(jié)核性胸膜炎的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是在結(jié)核性胸腔積液標(biāo)本上檢測到抗酸桿菌或者胸腔積液中培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌，或在胸膜活檢標(biāo)本中觀察到有干酪壞死的肉芽腫組織，并除外其他引起肉芽腫的疾病。由于病原學(xué)檢測陽性率低，胸膜活檢為有創(chuàng)性操作，且具有一定操作風(fēng)險(xiǎn)。所以，目前對于結(jié)核性胸膜炎的早期診斷尚缺乏靈敏度及特異度較好的指標(biāo)。由于結(jié)核性胸膜炎治療效果與治療早晚密切相關(guān)，如果能找到有良好診斷效率的免疫學(xué)指標(biāo)，則能大幅度提高臨床的診斷效率，從而提高結(jié)核性胸膜炎的治療效果。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)是通過檢測經(jīng)抗原刺激后分泌細(xì)胞因子的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)量評價(jià)細(xì)胞免疫功能的方法，具有快速、靈敏等特點(diǎn)［2］。目前已廣泛應(yīng)用于臨床上結(jié)核感染的診斷［3－5］。據(jù)報(bào)道，在診斷結(jié)核性疾病中有參考價(jià)值?；诖?，本研究通過ELISPOT方法檢測60例結(jié)核性及39例非結(jié)核性胸腔積液的γ干擾素水平，探討酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(ELISPOT)在結(jié)核性胸膜炎中的診斷價(jià)值。

1　資料與方法

1.1一般資料從2011年7月至2012年7月入住我科的胸腔積液患者99例，其中結(jié)核性胸膜炎患者60例(結(jié)核組)，男33例，女27例;年齡19～63歲，平均年齡(45.3±3.6)歲。結(jié)核性胸膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)如下: (1)臨床有結(jié)核中毒癥狀; (2)抗結(jié)核治療兩個(gè)月內(nèi)臨床癥狀改善，胸水吸收; (3)胸水或痰檢可見抗酸桿菌; (4)胸部影像學(xué)檢查可見結(jié)核灶; (5) PPD強(qiáng)陽性; (6)抗結(jié)核治療有效，半年內(nèi)胸水未復(fù)發(fā)。非結(jié)核性胸腔積液患者39例(對照組)，其中男17例，女22 例;年齡15～67歲，平均年齡(48.6±5.4)歲。對照組經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)、病理學(xué)、血清及影像學(xué)方法確診非結(jié)核性胸腔積液;其中腫瘤性胸腔積液36例，肺炎旁積液3例。

1.2方法

1.2.1采用英國Oxford Immunotec公司生產(chǎn)的TSpot-TB試劑盒，基本步驟如下:于治療前分別取枸櫞酸鈉抗凝新鮮胸腔積液100ml立即進(jìn)行檢測(樣本采集后2 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，4 h內(nèi)完成檢測)。用ELISPOT計(jì)數(shù)儀進(jìn)行斑點(diǎn)閱讀與統(tǒng)計(jì)。當(dāng)任一檢測孔達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽性結(jié)果:①如果空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)＜5個(gè)，檢測孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)＞6;②如果空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)＞6個(gè)，檢測孔斑點(diǎn)數(shù)必須＞2倍的空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)。

1.2.2所收集胸腔積液同步送胸液抗酸染色、結(jié)核菌培養(yǎng)、ADA及PCR檢測TB-DNA。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.160例結(jié)核組患者與39例對照組患者胸腔積液抗酸染色、培養(yǎng)、TB-DNA、ADA和ELISPOT檢測敏感性分別為18.3%，21.7%，36.7%，88.3%和91.7%。采用T-Spot-TB試劑盒ELISPOT方法檢測分別與抗酸染色、培養(yǎng)、TB-DNA兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05) ;與ADA比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1　ELISPOT檢測與其他指標(biāo)在結(jié)核性胸膜炎中陽性率比較n=60

2.2結(jié)核性胸膜炎組與對照組患者均行胸腔積液ELISPOT檢測及ADA檢測，ELISPOT檢測其敏感性91.7%、特異性84.6%，高于ADA檢測敏感性88.3%、特異性74.4%。見表2。

表2　ELISPOT檢測及ADA評價(jià)指標(biāo)比較　%

3　討論

結(jié)核性胸膜炎是胸腔積液最常見的病因，有研究顯示，結(jié)核性胸膜炎占胸膜疾病的49.6%，且發(fā)病呈逐年上升趨勢［6］。目前診斷結(jié)核性胸膜炎的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是胸水中找到或培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌，但其陽性率低［7］;胸膜活檢創(chuàng)傷較大而限制其臨床廣泛應(yīng)用;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測TB-DNA由于其假陽性率高而影響了結(jié)果的可靠性［8］。本研究中，抗酸染色涂片陽性率18.3%，結(jié)核菌培養(yǎng)陽性率為21.7%、熒光定量PCR(TB-DNA)的陽性率僅36.7%。因此，找到一種快速、敏感的免疫學(xué)診斷指標(biāo)對結(jié)核性胸膜炎的診斷至關(guān)重要。

近來，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(enzyme-linked immunospotassay，ELISPOT)檢測技術(shù)已經(jīng)成為一種新的結(jié)核分枝桿菌感染的快速診斷工具［9］。結(jié)核菌感染誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫以Th1型細(xì)胞免疫為主，IFN-γ是其分泌的主要細(xì)胞因子。IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，具有抗病毒、抗細(xì)胞活性及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中其他細(xì)胞反應(yīng)的作用。在機(jī)體的抗結(jié)核免疫反應(yīng)中，IFN-γ激活宿主單核細(xì)胞，使其在病灶集聚，并控制感染播散，最終形成結(jié)核性肉芽腫;且刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，由NO介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)，從而殺死結(jié)核桿菌［10］。在體外試驗(yàn)中，由PPD刺激后，結(jié)核性胸腔積液中的淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生高濃度的IFN-γ。而結(jié)核性胸腔積液中增多的CD4+T淋巴細(xì)胞則被認(rèn)為是IFN-γ的主要來源。T-Spot-TB是利用結(jié)核特異抗原:早期分泌抗原靶6 kD (early secretory antigenic target 6000) ESAT-6、培養(yǎng)濾液蛋白10 kD (culture filtrate protein 10 000) CFP-10，通過ELISPOT檢測受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而判斷目前該受試者是否感染結(jié)核桿菌的新方法。

近年來外周血單個(gè)核細(xì)胞結(jié)核菌特異性IFN-γ ELISPOT檢測技術(shù)已廣泛應(yīng)用于活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷。而直接來源于胸膜腔的胸液較外周血更能準(zhǔn)確的反應(yīng)出疾病的狀況［11］。結(jié)核性胸膜炎時(shí)，人體局部細(xì)胞免疫增強(qiáng)，尤其以Th1免疫應(yīng)答為主，因此IFN-γ水平升高。在各種類型的肺外結(jié)核中，結(jié)核菌抗原特異效應(yīng)的T淋巴細(xì)胞，可以轉(zhuǎn)移至感染的局部區(qū)域［12］，并且釋放出各種細(xì)胞因子，因而病灶局部結(jié)核菌抗原特異效應(yīng)的T淋巴細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于外周血的數(shù)量，即抗原特異效應(yīng)的T淋巴細(xì)胞的隔室化特征。本研究采用ELISPOT檢測60例結(jié)核性胸膜炎中，55例陽性，其檢測的敏感性為91.7%，特異性為84.6%?？顾崛旧科舾行?8.3%，結(jié)核菌培養(yǎng)敏感性為21.7%、熒光定量PCR(TB-DNA)的敏感性為36.7%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，采用T-Spot-TB試劑盒用ELISPOT方法檢測結(jié)核組與對照組的胸腔積液分別與抗酸染色、結(jié)核菌培養(yǎng)、熒光定量PCR兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ELISPOT方法檢測結(jié)核組與對照組的胸腔積液與ADA比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。本研究結(jié)果顯示ELISPOT檢測的敏感性遠(yuǎn)高于抗酸染色涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)、熒光定量PCR等常規(guī)胸水檢測項(xiàng)目。

ADA是人體嘌呤核苷代謝中催化腺苷和脫氧腺苷生成次黃苷和脫氧次黃苷的一種酶。ADA廣泛存在于全身各組織細(xì)胞中，淋巴細(xì)胞特別是T淋巴細(xì)胞內(nèi)的含量最高。ADA的活性增高與T細(xì)胞的激活、增殖與分化相關(guān)。結(jié)核性胸膜炎時(shí)，T細(xì)胞受到抗原刺激增多，其A DA在胸腔積液中的含量也明顯增高。腺苷脫氨酶ADA作為傳統(tǒng)診斷結(jié)核性胸膜炎的重要輔助指標(biāo)已有廣泛報(bào)道，本研究中ADA檢測60例結(jié)核性胸膜炎中，53例陽性，敏感性88.3%，特異性74.4%。而ELISPOT檢測的敏感性為91.7%，特異性為84.6%要更高于ADA檢測。提示結(jié)核性胸膜炎胸液ELISPOT檢測在結(jié)核性胸膜炎的早期診斷中具有較胸液ADA檢測更高的敏感性，可作為診斷結(jié)核性胸膜炎的重要輔助診斷指標(biāo)。如果ELISPOT檢測同ADA檢測聯(lián)合則可進(jìn)一步提高結(jié)核性胸膜炎的診斷效率，使患者得到及早的診斷及治療。

有研究表明，ELISPOT檢測的結(jié)果其斑點(diǎn)數(shù)與結(jié)核活動(dòng)程度相關(guān)，但并不能精確地區(qū)分出潛伏感染與活動(dòng)性結(jié)核［13］。本研究結(jié)果顯示39例非結(jié)核性胸膜炎的對照組中，6例ELISPOT檢測的結(jié)果陽性，其陽性率15.4%，使得ELISPOT檢測的特異度偏低。綜上所述，ELISPOT檢測技術(shù)診斷結(jié)核性胸膜炎其敏感性較高，在結(jié)核性胸膜炎的早期診斷中具有一定的輔助診斷價(jià)值。本次研究受到樣本量的限制，尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)此次試驗(yàn)結(jié)論。

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(收稿日期:2014－11－21)

通訊作者:楊永輝，050041河北省胸科醫(yī)院結(jié)核一科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.024

【文章編號】1002－7386(2015) 08－1191－03

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【中圖分類號】R 521.7