李曉燕　趙杰　趙麗雅　郝雪濤　許娜娜

黏液性銅綠假單胞菌的耐藥性分析

李曉燕趙杰趙麗雅郝雪濤許娜娜

【摘要】目的分析銅綠假單胞菌(PAE)對(duì)抗菌藥物的耐藥情況，為臨床合理使用抗菌藥物提供依據(jù)。方法應(yīng)用K-B法分別測(cè)試110株黏液型和110株非黏液型銅綠假單胞菌對(duì)常用的13種抗菌藥物的敏感性，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果黏液型銅綠假單胞菌對(duì)美洛培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢曲松、慶大霉素的敏感率明顯高于黏液型銅綠假單胞菌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，對(duì)亞胺培南、阿米卡星、妥布霉素、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、環(huán)丙沙星、氨曲南、左氧沙星的敏感性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論黏液型PA體外藥敏試驗(yàn)?zāi)退幮暂^低，但體內(nèi)用藥治療效果不佳，而使用體外藥敏試驗(yàn)敏感藥物與能抑制細(xì)菌表面生物膜作用的藥物聯(lián)合使用，治療效果較為明顯。

【關(guān)鍵詞】黏液型銅綠假單胞菌;耐藥性;生物膜;抗菌藥物

作者單位: 056001河北省邯鄲市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科

近年來(lái)，銅綠假單胞菌(PAE)感染增多，且治療十分棘手，常出現(xiàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床治療不一致的現(xiàn)象，其原因之一是生物膜的形成。銅綠假單胞菌根據(jù)菌落形態(tài)及是否產(chǎn)生大量藻酸鹽，可將PAE黏液型和非黏液型2個(gè)型別［1］。黏液型PAE極易吸附于導(dǎo)管、黏膜表面形成生物膜，引起臨床難治性感染［2］?，F(xiàn)對(duì)我院分離的110株黏液型PAE和110株非黏液型PAE進(jìn)行藥敏分析，并進(jìn)一步探討大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)與喹諾酮類(lèi)藥物聯(lián)合運(yùn)用對(duì)黏液型PAE的治療效果，為臨床提供更可靠有利的藥敏結(jié)果。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料選取2011年6月至2013年5月河北省邯鄲市中心醫(yī)院住院患者的痰標(biāo)本，從標(biāo)本中共分離的黏液型和非黏液型PAE各110株，同一患者多次分離到的菌株不重復(fù)計(jì)入。

1.2試劑所有菌株經(jīng)常規(guī)分離培養(yǎng)后，用梅里艾廠家提供的Vitec2及配套GN鑒定板進(jìn)行菌株鑒定。血平板及中國(guó)蘭平板由天津金章公司提供，藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，藥敏紙片包括亞胺培南、美洛培南、阿米卡星、妥布霉素、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、左氧沙星、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、慶大霉素、氨曲南。

1.3菌株分離與鑒定標(biāo)本培養(yǎng)、分離嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作程序》第3版進(jìn)行。

1.3.1黏液性PAE的菌落形態(tài):經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h，粘液性銅綠在血板上生長(zhǎng)為無(wú)色、小露滴樣、邊

緣不規(guī)則、不溶血小菌落、48 h長(zhǎng)大而融合、粘稠、膠凍樣菌落、溶血不典型、可有可無(wú)。用接種環(huán)挑起無(wú)金屬光澤、無(wú)特殊氣味的菌落，分純后經(jīng)過(guò)法國(guó)梅里艾VITEK2Compact鑒定為PAE，判定為黏液型PAE。

1.3.2非黏液型PAE的菌落形態(tài):經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h，黏液型銅綠在血板上生長(zhǎng)為大而扁平、濕潤(rùn)、有金屬光澤、藍(lán)綠色、透明溶血環(huán)的菌落、有生姜味。分純后經(jīng)過(guò)法國(guó)梅里艾VITEK2Compact鑒定為銅綠假單胞菌，判定為非黏液型PAE。

1.4藥敏試驗(yàn)與結(jié)果判讀用標(biāo)準(zhǔn)濃度紙片法(Kirby-Bauer)法對(duì)13種常用抗生素做敏感性試驗(yàn)。使用銅綠假單胞菌ATCC27853進(jìn)行質(zhì)控。非黏液型銅綠假單胞菌采用24 h的結(jié)果判讀。因?yàn)轲ひ盒豌~綠假單胞菌生長(zhǎng)緩慢，常規(guī)24 h在MH板上判讀會(huì)造成假陰性，所以采用培養(yǎng)48 h的結(jié)果，或是血MH板24 h判讀(因?yàn)樵摼谘狹H上生長(zhǎng)良好)，判讀按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)2011年的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1黏液型與非黏液型銅綠假單胞菌耐藥性分析中介納入敏感合計(jì)為敏感株，黏液型PAE對(duì)美洛培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢曲松、慶大霉素的敏感率高于非黏液型PAE，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，對(duì)亞胺培南、阿米卡星、妥布霉素、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、環(huán)丙沙星、氨曲南、左氧沙星的敏感性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.2黏液型PAE的治療效果110株黏液型PAE隨機(jī)分為2組。其中一組單用表1藥敏結(jié)果(左氧沙星)進(jìn)行抗菌藥物治療(對(duì)照組)，另一組用左氧沙星與

表1　黏液型與非黏液型銅綠假單胞菌對(duì)13種抗菌藥物敏感性比較　種(%)

大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物聯(lián)用治療(試驗(yàn)組)，這2組都治療2周后復(fù)檢，再次復(fù)檢沒(méi)有培養(yǎng)出黏液型PAE的為治療有效，培養(yǎng)出黏液型PAE的為治療無(wú)效。2組治療黏液型PAE有效率不等，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=42.9，P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2　2組治療黏液型PAE有效率的比較

3　討論

PAE是假單胞菌屬中最為常見(jiàn)的致病菌之一，近年來(lái)，PAE在醫(yī)院的分離率一直居高不下，且耐藥性強(qiáng)、難以根除，已成為臨床治療的難點(diǎn)［3］。

其耐藥的原因主要有以下幾個(gè)方面: (1)產(chǎn)生多種滅活酶或鈍化酶，如Ampe酶、超廣譜B一內(nèi)酰胺酶和金屬酶; (2)基因的突變，如DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶及DNA回旋酶突變，膜的通透性下降，主動(dòng)外排泵系統(tǒng)的過(guò)量表達(dá); (3)生物被膜，細(xì)菌生物被膜(biofilm)在PAE感染中廣泛存在，是導(dǎo)致抗菌治療失敗的重要原因之一; (4) DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)，PAE的耐藥機(jī)制極為復(fù)雜，它對(duì)某一類(lèi)抗菌藥物的耐藥常是幾種機(jī)制協(xié)同作用;它對(duì)不同抗菌藥物的耐藥機(jī)制也不完全相同，而且還不斷有新的耐藥機(jī)制出現(xiàn)［4］。

從附表1可以看出，黏液型PAE的體外敏感抗生素較多，耐藥性較弱，且弱于非黏液型PAE的耐藥性。這表明在不考慮，黏液型PAE形成生物膜的情況下，選用抗生素的范圍要比非，黏液型PAE廣得多。黏液型PAE是PAE在自然界中存在的一種特殊形式，非黏液型PAE在一定的條件下可轉(zhuǎn)化成黏液型PAE，其表面存在大量以多糖藻酸鹽為主要成分的粘液，從而可形成生物膜［5，6］。藻酸鹽是黏液型銅綠假單胞菌形成生物被膜的主要成分，可以使其能夠免于被藥物清除，造成其長(zhǎng)期定值［7］，造成慢性、反復(fù)性感染，同時(shí)也會(huì)造成藥敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床治療效果不相符合，給用藥帶來(lái)困難。體外研究發(fā)現(xiàn)，藻酸鹽在，黏液型PAE生物被膜的形成中發(fā)揮著重要的作用，所以除去生物被膜必須設(shè)法減少藻酸鹽的合成。

從表2我們可以明顯的看出聯(lián)合用藥的治療效果明顯優(yōu)于單一用藥。按藥敏結(jié)果來(lái)看，左氧可以用于治療黏液型PAE的經(jīng)驗(yàn)治療藥物，可是從表2中看出左氧治療黏液型PAE的效果相當(dāng)?shù)牟缓?，治愈率僅為14.55%(8/55)。所以在治療黏液型PAE時(shí)必須考慮其生物被膜的影響。而第二組用左氧沙星與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物聯(lián)用大大提高了其殺菌效果，55例患者經(jīng)聯(lián)合用藥治療2周后，有44例均有不同程度的好轉(zhuǎn)，其微生物檢查結(jié)果:未檢出黏液型PAE。其治愈率為80.00%(44/55)。

PAE生物膜的主要成分是胞外黏多糖，而黏多糖的主要成分是藻酸鹽。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素通過(guò)抑制藻酸鹽生物合成途徑中的二磷酸甘露糖脫氫酶(GMD)活性［8］，減少藻酸鹽合成，從而破壞黏液型PAE表面的生物膜，降低細(xì)菌的黏附性，使敏感藥物的治療效果明顯增強(qiáng)。有研究表明，部分大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物如阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素等能有效減低生物被膜的抵抗作用，與體外敏感藥物聯(lián)合運(yùn)用，能使敏感藥物容易穿過(guò)被膜屏障接觸到菌體，提高殺菌效果［9－11］，延長(zhǎng)患者的生命。筆者在左氧沙星與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中得出，兩藥聯(lián)用后的抗菌活性有很大程度地提高。

雖然左氧沙星與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物聯(lián)聯(lián)用于PAE等細(xì)菌生物被膜可以起到一定的增效作用，但尚未完全殺滅被膜下細(xì)菌。

黏液型PAE被膜的產(chǎn)生有多方面的原因，大量抗菌藥物的應(yīng)用及內(nèi)置管道等都易誘發(fā)生物膜的產(chǎn)生，臨床應(yīng)加強(qiáng)加大抗菌藥物的監(jiān)管和應(yīng)用，減少黏液型PAE引起的院內(nèi)感染，監(jiān)測(cè)抗菌藥物對(duì)黏液型PAE的耐藥性變化，及時(shí)為臨床提供抗菌藥物的耐藥性變化，指導(dǎo)臨床用藥。臨床醫(yī)師在治療黏液型PAE引起的感染時(shí)，應(yīng)根據(jù)病原菌特點(diǎn)結(jié)合藥敏結(jié)果合理選用抗菌藥物。另外，在抗菌藥物治療過(guò)程中，銅綠假單胞菌治療3～4 d后即可能發(fā)生耐藥，所以患者在治療過(guò)程中，應(yīng)隨時(shí)監(jiān)測(cè)抗生素的敏感性變化，調(diào)整治療方案，提高治療效果。

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(收稿日期:2014－10－23)

通訊作者:趙杰，056001河北省邯鄲市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科; E-mail: zjlxy1208@ sina.com

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.048

【文章編號(hào)】1002－7386(2015) 08－1247－03

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 378.991