馮凱　王瑞剛　趙春香　張磊

去骨瓣減壓對大鼠心肺復(fù)蘇后大腦中動脈血流、NF-κB及NSE蛋白表達(dá)的影響

馮凱王瑞剛趙春香張磊

【摘要】目的探討去骨瓣減壓術(shù)對心肺復(fù)蘇大鼠大腦中動脈血流的變化及NF-κB和NSE蛋白表達(dá)的影響。方法采用改良的窒息法制備大鼠復(fù)蘇模型，成年雄性Wistar大鼠48只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、對照組和去骨瓣干預(yù)組，每組16只。每組又分為A(6 h)、B(12 h)、C(24 h)、D(48 h) 4個亞組。對照組與去骨瓣干預(yù)組采用窒息致大鼠心臟驟停(CA)和心肺復(fù)蘇(CPR)模型。去骨瓣干預(yù)組在大鼠心肺復(fù)蘇成功1 h后行去骨瓣減壓。假手術(shù)組僅行氣管插管、股動靜脈置管術(shù)。激光多普勒血流儀(LDF)監(jiān)測大鼠心肺復(fù)蘇前后大腦中動脈血流的變化。在不同的時間點(diǎn)取大鼠靜脈血，離心留取血清，采用Elisa方法，檢測血清中NSE蛋白的表達(dá)，然后斷頭取腦，測定腦組織含水量，免疫組化檢測NF-κB表達(dá)，并分析其相關(guān)性。結(jié)果大腦中動脈血流:與假手術(shù)組比較，對照組、去骨瓣干預(yù)組大腦中動脈血流在自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后6 h降低，并持續(xù)降低至48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ;與對照組比較，去骨瓣干預(yù)組大腦中動脈血流在自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后6 h至48 h降低幅度較小，6 h、12 h、24 h、48 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。腦組織含水量:心肺復(fù)蘇成功后腦組織含水量于6 h開始升高，24 h達(dá)高峰，持續(xù)至48 h。假手術(shù)組腦組織含水量正常，對照組最高，去骨瓣干預(yù)組處于兩者之間。對照組和去骨瓣干預(yù)組比較，6 h、12 h、24 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。血清中NSE蛋白的濃度:與假手術(shù)組比較，對照組血清NSE蛋白在自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC) 后6 h明顯升高，并持續(xù)上升至12 h達(dá)峰值，24 h、48 h有所回落，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) ;與對照組比較，去骨瓣干預(yù)組ROSC后12 h、24 h、48 h血清中NSE蛋白的濃度顯著降低(P＜0.01)，但6 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。NF-κB的表達(dá):心肺復(fù)蘇后6 h腦組織NF-KB活性即增高并逐漸增強(qiáng)，于傷后24 h達(dá)高峰后迅速下降;對照組與去骨瓣干預(yù)組變化曲線相似，但對照組在每個時間點(diǎn)的陽性細(xì)胞數(shù)均高于去骨瓣干預(yù)組，其中在24 h、48 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，12 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但6 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論去骨瓣減壓能改善心肺復(fù)蘇后大腦中動脈血流速度，改善大鼠心肺復(fù)蘇后大腦中動脈血流量，從而減輕腦損傷;去骨瓣減壓能夠減輕腦水腫從而保護(hù)腦組織，減輕繼發(fā)性腦損傷，降低其病死率;心肺復(fù)蘇后NSE蛋白濃度的升高反映腦損傷的程度，去骨瓣干預(yù)組于12 h、24 h、48 h NSE蛋白濃度較對照組明顯降低，去骨瓣減壓能夠降低NSE蛋白的表達(dá)，減輕腦損傷;心肺復(fù)蘇成功12 h后對照組NF-κB表達(dá)水平比去骨瓣干預(yù)組高而且下降緩慢，提示它的持久激活可能是加重繼發(fā)性腦損傷的因素之一;

【關(guān)鍵詞】心肺復(fù)蘇;去骨瓣減壓;大腦中動脈血流;激光多普勒血流儀;腦水腫; NSE蛋白; NF-κB

項(xiàng)目來源:河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究指令性課題(編號: ZL20140143)

作者單位: 063000河北省唐山市，河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院NICU

E-mail: wangrg123@ tom.com

去骨瓣減壓手術(shù)最早被應(yīng)用于解除當(dāng)時無法定位的腦部腫瘤引起的顱內(nèi)壓升高，以后被越來越多的實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療證實(shí)此術(shù)式的療效［1－3］。采用超早期標(biāo)準(zhǔn)大骨瓣減壓術(shù)對重度顱腦損傷患者進(jìn)行治療可減少腦梗塞體積、保護(hù)半暗帶，改善神經(jīng)功能，降低病死率，但該項(xiàng)手術(shù)治療技術(shù)并未用于臨床心臟驟停復(fù)蘇腦保護(hù)中［3］。本研究通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索去骨瓣減壓術(shù)是否在治療心跳驟停復(fù)蘇腦保護(hù)方面有好的療效，并可做為心跳驟停復(fù)蘇腦保護(hù)早期較好的治療方法。本實(shí)驗(yàn)用LDF監(jiān)測大鼠大腦中動脈血流，擬通過應(yīng)用LDF監(jiān)測大鼠心肺復(fù)蘇后及去骨瓣減壓后大鼠大腦中動脈血流的動態(tài)變化［4］，并觀察大鼠心肺復(fù)蘇(CPR)后血清NSE蛋白和NF-κB表達(dá)的變化，評價(jià)去骨瓣減壓對心肺復(fù)蘇后腦保護(hù)的價(jià)值。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組成年清潔級雄性Wistar大鼠48只，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動物實(shí)驗(yàn)中心［許可證號: SCXK-(軍) 2009－003］，體重280～380 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、對照組、去骨瓣組，每組16只，再分別按氣管插管+股動靜脈置管術(shù)后(假手術(shù)組)或自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后(對照組、去骨瓣組) 6 h、12 h、24 h、48 h分為4個亞組，每個亞組4只。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不禁水。

1.2實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱鲄⒄諈⒖嘉墨I(xiàn)7的方法制作窒息性心跳驟停模型。腹腔注射9%水合氯醛(0.33 ml/100 g)麻醉，固定于鼠頭定位儀上，沿矢狀線起開頭皮，分離組織，用醫(yī)用棉簽擦拭筋膜，顯露顱骨矢狀線及前囟，用鼠頭定位儀定位前囟下2 mm、旁5 mm處，之后電動牙科鉆于定位點(diǎn)打孔，打孔以不打通顱骨為宜，用PF 5010 LDF監(jiān)測大腦中動脈血流，將光纖探頭用生物凝膠固定于打孔部位，連續(xù)1 h監(jiān)測大腦中動脈血流數(shù)值。1 h后取下大鼠，將大鼠固定于手術(shù)板上，針狀電極置于皮下，監(jiān)測ECG。分別行氣管插管和右側(cè)股動、靜脈置管術(shù)。氣管插管后連接TKR-200C小動物呼吸機(jī)，行高頻噴射通氣，吸入空氣，通氣頻率80次/min，通氣壓力＜0.02 MPa，根據(jù)大鼠胸廓起伏及呼吸是否抵抗調(diào)節(jié)通氣頻率。經(jīng)右股靜脈輸注乳酸鈉林格0.01 ml·g－1·h－1，股動脈接換能器監(jiān)測動脈壓及心率穩(wěn)定10 min。復(fù)蘇液:腎上腺素40 μg/kg。窒息前5 min靜脈注射維庫溴銨0.1 mg/kg、肝素500 U/kg。夾閉氣管導(dǎo)管直至ECG和有創(chuàng)動脈監(jiān)測示心電機(jī)械分離或心電活動消失，且MAP＜20 mm Hg，8 min后經(jīng)右股靜脈插管注入復(fù)蘇液，同時開放氣道，行機(jī)械通氣，并行心外按壓(按壓頻率200次/min，深度為胸廓前后徑的1/3)，動脈波形恢復(fù)且MAP＞40 mm Hg為按壓有效，自主循環(huán)恢復(fù)(MAP＞60 mm Hg，HR＞250次/min)為復(fù)蘇成功。死亡或復(fù)蘇時間超過10 min的大鼠剔除本研究，重新補(bǔ)充。1 h后結(jié)扎動靜脈，縫合皮膚，拔出氣管插管，完成窒息性心跳驟停復(fù)蘇模型。假手術(shù)組動物僅進(jìn)行麻醉和氣管插管、股動靜脈置管，不進(jìn)行夾管窒息及CPR。1.3去骨瓣干預(yù)治療去骨瓣組大鼠于窒息性心跳驟停復(fù)蘇模型成功1 h后，切開頭皮，擦拭分離筋膜，完全暴露另一側(cè)頂骨，用顯微牙科鉆在頂骨邊緣上均勻的打孔，配合牙科鑷將大鼠一側(cè)頂骨取下，骨瓣大小約9 mm×5 mm，放射狀切開硬腦膜，止血、縫合頭皮。1.4術(shù)后大腦中動脈血流的監(jiān)測各亞組大鼠分別于6、12、24、48 h后，再次監(jiān)測大腦中動脈血流值，將鼠頭固定于定位儀上，拆開縫合線，顯露顱骨定位打孔點(diǎn)，再次用PF 5010 LDF監(jiān)測大腦中動脈血流，將光纖探頭用生物凝膠固定于打孔部位，連續(xù)1 h監(jiān)測大腦中動脈血流數(shù)值。

1.5標(biāo)本的采集每亞組大鼠分別于術(shù)后6、12、24、48 h后腹腔麻醉，立即開胸暴露心臟，迅速取大鼠上腔動脈血2 ml(待離心)，之后速斷頭取腦，每只大鼠分別于矢狀線切開大腦，一半腦組織用于測定含水量，另一半迅速用4%多聚甲醛液固定24 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋，每個標(biāo)本連續(xù)切片2張，切片厚度5 μm，一張切片用于HE染色，另1張用于NF-KB免疫組化染色實(shí)驗(yàn)。將每只大鼠留取的靜脈血離心(3 500 r/min，10 min)，取上清液于EP管，置于－80℃冰箱保存，批量待測。測定血清NSE蛋白濃度，測定步驟嚴(yán)格按試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.6腦組織含水量測定用干濕重法測定腦含水量:將各時間點(diǎn)所取腦組織用濾紙吸盡腦表面血漬后，取腦組織約100 mg，稱得濕重值(Wetweight，WW)，然后在100℃干烤箱中持續(xù)烘干24 h，取出并稱得干重值(Dryweight，DW)，腦組織含水量計(jì)算公式為(WWDW)/WW。

1.7NF-KB免疫組化采用鏈霉素親和素-生物素-過氧化酶復(fù)合物法(SABC)，參照試劑盒說明書進(jìn)行染色，一抗為NF-κB p65 (F-6) (濃度為1∶50)，使用已知陽性切片做陽性對照，陰性對照用PBS代替一抗進(jìn)行免疫組化染色。每張切片隨機(jī)選取10個不重復(fù)視野(各組所選部位盡可能相同)，在高倍(10×40)鏡下觀察(相同條件)，運(yùn)用HMIAS-2000高清晰度圖像采集處理系統(tǒng)采圖。陽性細(xì)胞測定采取直接計(jì)數(shù)法:計(jì)算每個視野下陽性細(xì)胞數(shù)目，每個時間點(diǎn)6張切片的陽性細(xì)胞數(shù)目取其均值表示各切片的測定結(jié)果。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.13組大鼠大腦中動脈血流值的變化與假手術(shù)組比較，對照組、去骨瓣組大腦中動脈血流在自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后6 h降低，并持續(xù)降低至48 h，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ;與對照組比較，去骨瓣干預(yù)組大腦中動脈血流在自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后6 h 至48 h降低幅度較小，6 h、12 h、24 h、48 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1　3組大鼠大腦中動脈血流量的變化　n=4，pU/min，±s

表1　3組大鼠大腦中動脈血流量的變化　n=4，pU/min，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與去骨瓣組比較，#P＜0.05，△P＜0.01

組別0 h　6 h　12 h　24 h　48 h假手術(shù)組　231.930±21.393　234.278±24.383　237.923±13.291　229.748±16.704　228.055±21.629對照組　209.935±11.975*　189.018±9.476*　166.135±23.354*　112.105±12.169*　99.628±4.902*去骨瓣組　258.250±27.015*　246.665±28.251* #　233.053±25.519* #　210.665±24.336＊△　201.150±21.428*#

2.23組大鼠腦組織含水量變化心肺復(fù)蘇成功后腦組織含水量于6 h開始升高，24 h達(dá)高峰，持續(xù)至48 h。假手術(shù)組腦組織含水量正常，對照組最高，去骨瓣干預(yù)組處于兩者之間。對照組和去骨瓣干預(yù)組比較，6 h、12 h、24 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2　3組大鼠腦組織含水量變化　n=4，%，±s

表2　3組大鼠腦組織含水量變化　n=4，%，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，#P＜0.01;與去骨瓣干預(yù)組比較，△P＜0.05，☆P＜0.01

組別6 h　12 h　24 h　48 h假手術(shù)組　78.58±0.45　78.12±0.39　77.92±0.41　78.37±0.49對照組　79.98±0.53#　80.49±0.60#　81.46±0.47#　81.49±0.50#去骨瓣組　79.17±0.44＊△　79.72±0.41#△　80.83±0.52#☆　80.77±0.46#

2.33組大鼠血清中NSE蛋白濃度的變化與假手術(shù)組比較，對照組血清NSE蛋白在自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后6 h明顯升高，并持續(xù)上升至12 h達(dá)峰值，24 h、48 h有所回落，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) ;與對照組比較，去骨瓣干預(yù)組ROSC后12 h、24 h、48 h血清中NSE蛋白的濃度顯著降低(P＜0.01)，但6 h差異無顯著性(P＞0.05)。見表3。

表3　3組大鼠血清NSE蛋白含量的變化　n=4，μg/L，±s

表3　3組大鼠血清NSE蛋白含量的變化　n=4，μg/L，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.01;與去骨瓣干預(yù)組比較，#P＜0.01

組別6 h　12 h　24 h　48 h假手術(shù)組　597.375±9.513　662.425±49.576　645.125±63.326　638.925±62.707對照組　1460.000±216.506*　2228.750±205.523*　1766.250±108.733*　1503.750±89.849*去骨瓣組　1472.500±136.931*　1716.250±119.678* #　1491.250±96.555* #　1416.250±82.601*#

2.43組大鼠NF-κB陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比較心肺復(fù)蘇后6 h腦組織NF-κB活性即增高并逐漸增強(qiáng)，于傷后24 h達(dá)高峰后迅速下降;對照組與去骨瓣干預(yù)組變化曲線相似，但對照組在每個時間點(diǎn)的陽性細(xì)胞數(shù)均高于去骨瓣干預(yù)組，其中在12 h、24 h、48 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但6 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表4。

表4　3組大鼠NF-κB陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比較n=4，±s

表4　3組大鼠NF-κB陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比較n=4，±s

注:與去骨瓣干預(yù)組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

組別6 h　12 h　24 h　48 h對照組32.2±4.53　51.2±4.76　58.4±5.25　27.6±3.78去骨瓣組　28.5±4.08　46.5±3.41*　49.3±3.99* #　20.8±3.07*#

2.5HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)對照組:大腦皮層及海馬可見不同程度的神經(jīng)元細(xì)胞損傷表現(xiàn)。心肺復(fù)蘇后6 h組:可見大腦皮層及海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞輕度水腫，部分細(xì)分細(xì)胞核濃染，固縮。心肺復(fù)蘇后12 h組:神經(jīng)元細(xì)胞水腫加重，神經(jīng)氈疏松，大量細(xì)胞核濃染，固縮，局部可見少量三種深染單核淋巴細(xì)胞浸潤。心肺復(fù)蘇后24 h組:神經(jīng)元壞死明顯，數(shù)量減少，呈空泡狀，現(xiàn)存的細(xì)胞大部分固縮深染，核仁消失，部分核碎裂、溶細(xì)胞核固縮深染，核仁消失，部分細(xì)胞溶解，甚至消失，腦質(zhì)細(xì)胞增生;神經(jīng)氈明顯疏松，但組織結(jié)構(gòu)輪廓尚存。心肺復(fù)蘇后48 h組:神經(jīng)細(xì)胞失去完整結(jié)構(gòu)，核碎裂明顯，細(xì)胞周圍高度水腫，可見膠質(zhì)細(xì)胞增生。去骨瓣組: 6 h較對照組未見明顯變化，12 h、24 h、48 h后大腦皮層及海馬可見神經(jīng)元細(xì)胞壞死減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生，大量新生毛細(xì)血管。假手術(shù)組:神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)結(jié)構(gòu)分布正常，未見神經(jīng)元病理性損傷。

3　討論

3.1大腦中動脈血流與心肺復(fù)蘇腦對缺血與再灌注的天然脆弱性導(dǎo)致心臟驟停后腦損傷的后果尤為嚴(yán)重。大量神經(jīng)細(xì)胞受損導(dǎo)致患者出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重的出現(xiàn)昏迷、持續(xù)植物狀態(tài)甚至死亡。心臟驟停后腦損傷的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜。目前認(rèn)為，缺血缺氧是導(dǎo)致心肺復(fù)蘇后神經(jīng)功能損傷的始動因素，引起包括細(xì)胞內(nèi)酸中毒、鈣超載、興奮性氨基酸蓄積、氧自由基損傷以及細(xì)胞死亡通路的激活在內(nèi)的一系列復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)［6］。這些級聯(lián)反應(yīng)在腦組織缺血缺氧后4～6 min即刻發(fā)生，在自主循環(huán)恢復(fù)后仍可持續(xù)數(shù)小時至數(shù)日，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的海馬、皮層、小腦、紋狀體與丘腦的“選擇性易損神經(jīng)元”，可見變性、退化乃至壞死。針對復(fù)蘇后腦損傷治療的藥物很多，但效果均不理想。心跳驟停后，由于缺血缺氧導(dǎo)致大腦水腫，進(jìn)而導(dǎo)致大腦血流量降低，去骨瓣減壓從外科學(xué)角度，去除部分顱腦，從而達(dá)到減輕顱內(nèi)高壓，緩解顱內(nèi)高壓造成的腦細(xì)胞供血不足，本實(shí)驗(yàn)以此為出發(fā)點(diǎn)，通過心肺復(fù)蘇后去除大鼠顱腦頂骨，減輕顱內(nèi)高壓，對照組、去骨瓣組分別于6、12、24、48 h大腦中動脈血流值明顯較假手術(shù)組低，且呈逐漸降低趨勢。而去骨瓣組較對照組血流值下降幅度小，降低趨勢也較平緩。本研究結(jié)果證明去骨瓣減壓對心肺復(fù)蘇成功后腦血流的恢復(fù)具有積極意義，在早起起到緩解顱內(nèi)高壓，增高腦血流量的目的［7，8］。從早期改善心肺復(fù)蘇的預(yù)后。

3.2NSE與心肺復(fù)蘇神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，普遍存在于生物體內(nèi)的糖酵解代謝中，由三種亞基(A、B、C)組成5種烯醇化酶，其中rr型特異地存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的胞漿中，稱為NSE。NSE與乳酸脫氫酶、醛縮酶、肌酸激酶不同，它不與細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白結(jié)合，因而最易釋放出來。NSE是反映腦損傷最靈敏且意義最大的指標(biāo)。腦損傷后，NSE可以從缺血/損傷的神經(jīng)元中漏出，跨過血腦屏障進(jìn)入體循環(huán)。因而使血中NSE上升，故反映了中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損情況，且血標(biāo)本比CSF更易取得。因而檢測血漿或血清中的NSE具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，血清中NSE蛋白的濃度在自主循環(huán)恢復(fù)后6 h明顯升高，并持續(xù)上升至12 h達(dá)高峰，之后有所回落，去骨瓣干預(yù)組ROSC后血清中NSE蛋白的濃度顯著降低，反映了去骨瓣干預(yù)對心肺復(fù)蘇后腦保護(hù)起到了積極作用，減少腦細(xì)胞死亡率。

3.3NF-KB與心肺復(fù)蘇研究認(rèn)為NF-κB在炎性反應(yīng)時的內(nèi)皮細(xì)胞中起樞紐作用。因此我們推測: (1)腦損傷后早期NF-κBp65在血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中即可被激活，提示NF-κB在調(diào)控自由落體腦損傷后的多個病理生理過程中，這兩類細(xì)胞可能起主要作用;內(nèi)皮細(xì)胞激活是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵步驟，炎性損傷起初發(fā)生在腦的微血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，隨即累及周圍的神經(jīng)組織; (2)對照組24 h后NF-κB表達(dá)水平相對較高且下降緩慢，提示它的持久激活可能是加重繼發(fā)性腦損傷的因素之一，而去骨瓣干預(yù)組24 h后NF-κB在低水平表達(dá)且持續(xù)下降，提示其炎性反應(yīng)較輕，去大骨瓣減壓可能間接通過降低NF-κB表達(dá)繼而減輕炎性反應(yīng)來減輕腦損傷。

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(收稿日期:2014－11－20)

通訊作者:王瑞剛，063000河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院NICU;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.013

【文章編號】1002－7386(2015) 08－1163－04

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【中圖分類號】R 605.974