呂亮　張丹　貝雪艷　喬躍兵

膳食變化對(duì)大鼠下丘腦AgRP表達(dá)的影響

呂亮張丹貝雪艷喬躍兵

【摘要】目的分析膳食變化對(duì)大鼠下丘腦刺鼠相關(guān)蛋白(AgRP)表達(dá)的影響，探討AgRP在肥胖發(fā)生中的作用，為肥胖的研究提供一個(gè)新的思路。方法將80只體重為100～120 g的雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成高能飼料組(n=40)、饑餓組(n=20)、對(duì)照組(n=20)。高能組給予自制的高能飼料，對(duì)照組和饑餓組給予基礎(chǔ)大鼠飼料。12周后，高能組體重超過對(duì)照組平均體重30%的大鼠設(shè)為膳食誘導(dǎo)肥胖(DIO)組，饑餓組給予72 h禁食，自由飲水。取大鼠下丘腦采用免疫組化實(shí)驗(yàn)和western blot檢測(cè)AgRP表達(dá)。結(jié)果免疫組化顯示DIO組大鼠和饑餓組大鼠下丘腦AgRP表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05) ;而DIO組大鼠和饑餓組下丘腦AgRP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示DIO組和饑餓組大鼠下丘腦AgRP表達(dá)明顯高于對(duì)照組大鼠(P＜0.01)。而DIO組大鼠和饑餓組大鼠下丘腦AgRP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.01)。結(jié)論長(zhǎng)期高能飲食導(dǎo)致肥胖，其下丘腦內(nèi)AgRP表達(dá)的增高可能是導(dǎo)致機(jī)體攝食量和體重增加并引起肥胖的主要因素之一。饑餓狀態(tài)下，下丘腦內(nèi)AgRP表達(dá)增高，可能是由于在饑餓狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)瘦素、胰島素、糖的減少共同所致。

【關(guān)鍵詞】高能飲食;饑餓;食源性肥胖;刺鼠相關(guān)蛋白;下丘腦弓狀核

項(xiàng)目來源:河北省科學(xué)研究與發(fā)展支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào): 08276101D-20)

作者單位: 067000河北省承德市，承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院(呂亮、貝雪艷) ;承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院(張丹) ;承德醫(yī)學(xué)院研究生處(喬躍兵)

刺鼠相關(guān)蛋白(agouti-related protein，AgRP)又稱之為刺鼠相關(guān)肽。AgRP作為神經(jīng)肽Y(NPY)的同源性物質(zhì)，是一種強(qiáng)效和長(zhǎng)效的食欲刺激物質(zhì)。下丘腦中的AgRP可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合黑素皮質(zhì)素受體3和黑素皮質(zhì)素受體4(MC3-R和MC4-R)，拮抗a-黑素細(xì)胞刺激素(a-melanocyte-stimulating hormone，a-MSH)，從而促進(jìn)食欲和減少能量的消耗，導(dǎo)致肥胖。最近的研究顯示AgRP不禁可以增加食欲，而且對(duì)食物的選擇性攝取也有顯著影響，可以選擇性增加高脂、高熱量食物的攝入，本研究探討膳食改變對(duì)AgRP表達(dá)的影響及其在肥胖發(fā)生中的作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物80只雄性SPF級(jí)Wistar大鼠，體重100～120 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào): SCXK(京) 2007-0001。大鼠隨機(jī)分為3 組:高能飼料組(n=40)給予自制高能飼料;對(duì)照組(n=20)給予基礎(chǔ)大鼠飼料;饑餓組(n=20)給予基礎(chǔ)大鼠飼料。喂養(yǎng)12周后，高能飼料組動(dòng)物體重超過對(duì)照組平均體重30%者，設(shè)為膳食誘導(dǎo)肥胖組(DIO 組) ;體重未超過對(duì)照組平均體重的大鼠，棄之不要。對(duì)照組繼續(xù)喂養(yǎng)，饑餓組的大鼠在喂養(yǎng)12周后，禁食72 h，期間自由飲水，斷頭取腦組織。

1.2動(dòng)物飼料對(duì)照組給予基礎(chǔ)大鼠飼料;高能飼料組制作方法如下:按照100 g標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料，加25 g熔化的豬油、17 g白糖和17 g雞蛋、8.4 g奶粉的比例混勻，加適量水，用攪拌機(jī)攪勻，將配好的飼料機(jī)制成標(biāo)準(zhǔn)飼料大小的團(tuán)塊，陰干備用。

1.3主要試劑兔抗大鼠AgRP多克隆抗體(稀釋度: 1∶500)，美國(guó)Santa Cruz公司，蛋白marker(美國(guó)Fermentas公司)，兔抗大鼠β-actin單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司，稀釋度: 1∶1 000)，羊抗兔二抗(美國(guó)KPL公司稀釋度1∶5 000)，免疫組化試劑盒，由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4方法

1.4.1取材: DIO組、饑餓組和對(duì)照組大鼠各20只，用6%的水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，迅速斷頭取腦組織，以視交叉和乳頭體后緣的冠狀面為界取下丘腦組織，將樣品保存于液氮罐中備用。

1.4.2免疫組化檢測(cè): AgRP在下丘腦弓狀核表達(dá)的變化:每組取5例下丘腦組織，包埋，切片，行免疫組化染色，一抗?jié)舛葹?∶500。圖像采用ImagePro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析，每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野，測(cè)定每個(gè)視野累計(jì)光密度(IOD)值，以10個(gè)視野的平均值來表示。

1.4.3Western Blot檢測(cè)下丘腦AgRP表達(dá)的變化:各組取15例下丘腦組織，提取蛋白并定量。制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、Ⅰ抗孵育2 h，兔抗大鼠AgRP多克隆抗體(1∶500)、Ⅱ抗孵育2 h，羊抗兔二抗(1∶5 000)，顯影。膠片掃描圖像用Bandleader(3.0)軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白條帶與內(nèi)參照(β-actin)的灰度比值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，各組間資料比用方差分析(ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.13組大鼠下丘腦AgRP的表達(dá)(IHC)AgRP表達(dá)在下丘腦弓狀核胞漿內(nèi)，呈棕黃色。DIO組和饑餓組著色細(xì)胞數(shù)多、著色深。大鼠AgRP表達(dá)的累計(jì)光密度(IOD) DIO組(5 531±330)和饑餓組(4 902±410)明顯高于對(duì)照組(920±326)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，高能飼料組與饑餓組AgRP蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1，圖1～6。

表1　3組大鼠下丘腦AgRP表達(dá)比較　n=5，±s

表1　3組大鼠下丘腦AgRP表達(dá)比較　n=5，±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01

組別IOD對(duì)照組920±410 DIO組　5 531±330*饑餓組　4 902±326*

圖1　AgRP在對(duì)照組的表達(dá)(免疫組化×100)

圖2　在對(duì)照組的表達(dá)(免疫組化×400)

圖3　AgRP在DIO的表達(dá)(免疫組化×100)

圖4　AgRP在DIO組的表達(dá)(免疫組化×400)

圖5　AgRP在饑餓組的表達(dá)(免疫組化×100)

圖6　AgRP在饑餓組的表達(dá)(免疫組化×400)

2.23組大鼠下丘腦組織中AgRP的表達(dá)情況

14kD處均可見清晰目的條帶。內(nèi)參條帶清晰，亮度均一，無其他雜帶。高能飼料組(0.99±0.01)、饑餓組(0.87±0.02)表達(dá)較對(duì)照組(0.67±0.01)明顯升高(P＜0.05)。高能飼料組與饑餓組AgRP蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2、圖7。

表2　3組大鼠下丘腦組織中AgRP表達(dá)n=15±s

表2　3組大鼠下丘腦組織中AgRP表達(dá)n=15±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01

組別　Ratio of optical density (Agrp/β-actin) DIO組　0.99±0.01*對(duì)照組　0.62±0.02饑餓組　0.87±0.01*

3　討論

肥胖引起的原因非常復(fù)雜，是由內(nèi)在的因素和外在的因素長(zhǎng)期共同作用所致，腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)機(jī)體能量代謝的影響一直是學(xué)者研究的重點(diǎn)。腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分兩類，一類是促進(jìn)食欲的神經(jīng)肽，如NPY、AgRP等;另一類是抑制食欲的神經(jīng)肽，如α-MSH、CART等。AgRP的研究在國(guó)外開展的較多，也是能量代謝研究的一個(gè)新領(lǐng)域，這方面的研究在國(guó)內(nèi)開展的較少，隨著越來越多的學(xué)者對(duì)AgRP認(rèn)識(shí)和研究的深入，人們逐漸提出這樣一個(gè)問題: AgRP在能量代謝中的角色是什么，在肥胖發(fā)生的過程中AgRP又起著什么樣的作用。

AgRP是大腦內(nèi)AgRP/NPY神經(jīng)元產(chǎn)生的一種肽，又稱之為刺鼠相關(guān)肽。是由132個(gè)氨基酸組成的旁分泌信號(hào)分子，組成大鼠AgRP的132個(gè)氨基酸和人類AgRP的氨基酸組成有81%是一致的。AgRP主要表達(dá)在下丘腦和腎上腺組織，在睪丸、腎和肺臟的表達(dá)較低。AgRP已被證實(shí)是黑皮質(zhì)素受體的反向激動(dòng)劑，尤其是對(duì)MC-3R和MC4-R。黑皮質(zhì)素受體MC3-R 和MC4-R與新陳代謝和體重有著直接的關(guān)系，這些受體通常被促黑激素(α-MSH)激活，而被AgRP所抑制。促黑激素對(duì)大多數(shù)的黑皮質(zhì)素受體有激活作用(除外MC2-R)，然而AgRP僅僅對(duì)MC3-R and MC4-R有高度特異性。AgRP的這種反向激動(dòng)作用不僅僅對(duì)黑皮質(zhì)素，比如α-MSH起作用，更能通過受累的細(xì)胞減少cAMP的生成。AgRP抑制黑皮質(zhì)素受體信號(hào)的確切機(jī)制目前還不完全清楚，有人認(rèn)為AgRP和α-MSH結(jié)合扮演著一個(gè)配體結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑作用［1］。由于AgRP和NPY由同一神經(jīng)元產(chǎn)生，能影響NPY合成與釋放的因素也同樣能影響AgRP。作為NPY的同源性物質(zhì)，AgRP在促進(jìn)飲食、增加體重方面的作用比NPY要更加持久［2］。饑餓、ob/ob和db/db小鼠的AgRPmRNA表達(dá)明顯上調(diào)［3］。正常小鼠和ob/ob小鼠注射Leptin可以抑制AgRPmRNA的表達(dá)。有試驗(yàn)顯示.Leptin通過作用于ARC的NPY/AgRP神經(jīng)元來影響NPY和AgRP的釋放。

在本次試驗(yàn)的過程中，40只Wistar大鼠在長(zhǎng)達(dá)12周的高脂飲食喂養(yǎng)下，有27只大鼠發(fā)展成DIO大鼠，高達(dá)近70%的比例，這一數(shù)據(jù)充分說明了飲食因素在肥胖發(fā)展中的重要性。

據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)期進(jìn)行高脂高熱量喂養(yǎng)發(fā)展為肥胖的大鼠，其下丘腦弓狀核內(nèi)AgRP的表達(dá)會(huì)顯著地增高，提示AgRP的表達(dá)增高可能是導(dǎo)致大鼠肥胖的重要原因［4］。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，DIO大鼠無論在Western Blot實(shí)驗(yàn)還是免疫組化，其下丘腦內(nèi)的AgRP的表達(dá)都明顯的高于對(duì)照組，這一結(jié)果與國(guó)外的報(bào)道一致，提示DIO大鼠下丘腦內(nèi)AgRP表達(dá)的上調(diào)是導(dǎo)致大鼠肥胖的重要因素之一。

有資料顯示，在大鼠喂養(yǎng)狀態(tài)下，瘦素能夠抑制AgRP的表達(dá)，但是這種抑制在以下情況會(huì)被解除: (1)瘦素或功能性的瘦素受體缺乏; (2)在饑餓狀態(tài)下循環(huán)中的瘦素水平下降［5－7］。

在本次實(shí)驗(yàn)中，饑餓組的大鼠在經(jīng)過12周的普食喂養(yǎng)，人為給予72 h的禁食后，Western Blot和免疫組化研究結(jié)果同對(duì)照組比較顯示下丘腦內(nèi)AgRP的表達(dá)也顯著的增高，可能是由于饑餓使瘦素水平下降，對(duì)AgRP的抑制減弱，AgRP表達(dá)增強(qiáng)［7］。

圖7　3組Agrp在下丘腦弓狀核中的表達(dá)

參考文獻(xiàn)

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3Lin S，Storlien LH，Huang XF.Leptin receptor，NPY，POMC mRNA expression in the diet-induced obese mouse brain.Brain Res，2000，875: 89-95.

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Effect of dietary change on the expression of AgRP in hypothalamus of rats

LV Liang*，ZHANG Dan，BEI Xueyan*，et al.*
Nursing Occupational College of Chengde City，Hebei，Chengde 067000，China

【Abstract】Objective To observe the effect of dietary change on the expression of AgRP in hypothalamus of rats，and to explore the action mechanism of AgRP in pathogenesis of obesity.Methods Eighty male Wistar rats weighted 100～120g were randomly divided into high-energy diet group (n=40)，hunger group (n=20)，control group (n=20).The rats in high-energy diet group were given self-made high-energy food，the rats in control group and hunger group were fed with basal food.After 12 weeks，the rats in high-energy diet group whose weight exceeded 30% of mean weight in control group were regarded as diet-induced obesity group (DIO group)，however，the rats in hungry group were fasted for 72h，free to drink in the meantime.Then the expression levels of AgRP were detected by immunohistochemistry (IHC) and Western Blotting for all the rats.Results The results by IHC showed that the expression levels of AgRP in hypothalamus of rats in DIO group (5531.10 ±330.40) and hungry group (4901.67±410.24) were significantly higher than those in control group(919.62±325.98) (P＜0.01)，however，there were no significant differences between DIO group and hungry group (P＞0.05).The results by Western blotting showed that the expression levels of AgRP in hypothalamic of rats in DIO group(0.99±0.01) and hungry group(0.87±0.02) were significantly higher than those in control group(0.67±0.01) (P＜0.01)，but there were no significant differences between DIO group and hungry group (P＞0.05).Conclusion Long-term high-energy diet can result in obesity，and the overexpression of AgRP in hypothalamus may be one of the main factors which can lead to the increase of food intake，weight gain and obesity.During starvation condition，the increase of AgRP expression in hypothalamus may be caused by the common effects of the reduction of leptin，insulin and sugar within organism.

【Key words】high-energy diet; hunger; diet-induced obesity; agouti-related protein; hypothalamic arcuate nucleus

(收稿日期:2014－10－20)

通訊作者:喬躍兵，067000承德醫(yī)學(xué)院研究生處; E-mail: qiaoyuebing@126.com

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.004

【文章編號(hào)】1002－7386(2015) 08－1135－03

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】R 589.25