王亞玲　楊蓉　金鑫　連宏光　李擁軍

病毒性心肌炎脂聯(lián)素表達(dá)及替米沙坦的干預(yù)效果

王亞玲楊蓉金鑫連宏光李擁軍

【摘要】目的探討替米沙坦對病毒性心肌炎小鼠脂聯(lián)素，腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響。方法制備柯薩奇B3病毒感染的心肌炎小鼠60例，其中30例自病毒感染之日并連續(xù)7 d喂食替米沙坦作為觀察組;另外30例無藥物干預(yù)的心肌炎小鼠作為對照組;10例未感染病毒也無藥物干預(yù)的小鼠作為空白組。觀察3組小鼠的心肌病理組織學(xué)積分;組織病理改變;雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法測定血清脂聯(lián)素、TNF-α濃度。結(jié)果喂食替米沙坦的觀察組血清脂聯(lián)素水平明顯高于未藥物干預(yù)的對照組，而TNF-α、病理積分均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與空白組相比，觀察組血清脂聯(lián)素、TNF-α、病理積分水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與空白組相比，對照組血清脂聯(lián)素降低，而TNF-α、病理積分水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對照組小鼠接種病毒后第7天，可見心肌水腫、炎性細(xì)胞浸潤、心肌細(xì)胞變性壞死等，觀察組心肌炎癥細(xì)胞較對照組明顯減少。結(jié)論替米沙坦能夠增加對心臟有保護(hù)作用的脂聯(lián)素表達(dá)，減少TNF-α的分泌，減少心肌炎癥損傷。

【關(guān)鍵詞】替米沙坦;病毒性心肌炎;脂聯(lián)素;腫瘤壞死因子-α

項(xiàng)目來源:河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)科技研究計(jì)劃(編號: 2009 0102)

作者單位: 050000石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科(王亞玲、楊蓉、金鑫、李擁軍)，病理科(連宏光)

病毒性心肌炎是由病毒感染(尤其是柯薩奇病毒B)所致局限性或彌散性心肌炎性病變，其發(fā)病有逐年增高趨勢，最終導(dǎo)致心力衰竭。目前臨床尚無十分有效的病毒性心肌炎治療方法。Kanda等［1］研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞分泌表達(dá)脂聯(lián)素，而脂聯(lián)素能預(yù)防心室重構(gòu)、心力衰竭的發(fā)生。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑能誘導(dǎo)脂聯(lián)素的表達(dá)，發(fā)揮心臟保護(hù)作用［2］。本研究觀察比較具有過氧化物酶體增殖物激活型受體(peroxisome proliferator activited receptors，PPARs)激動(dòng)劑效應(yīng)的血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑替米沙坦干預(yù)后病毒性心肌炎小鼠心肌脂聯(lián)素，腫瘤壞死因子-α水平的變化，從而探討更有效改善病毒性心肌炎預(yù)后，減少心力衰竭發(fā)生的治療方法，為臨床實(shí)踐提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物4～6周齡雄性清潔級，近交系BALB/C小鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供(合格證號:冀1動(dòng)字第04045)共計(jì)70只，體重約(16.5±1.1) g。動(dòng)物室保持空氣流通，相對濕度在60%左右，溫度(22±2)℃。全部小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，并全程觀測記錄一般情況。

1.2病毒柯薩奇B3 (CVB3) Nancy病毒株(由河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室提供)經(jīng)Hep2細(xì)胞活化增殖，CPE達(dá)75%以上時(shí)收獲，其滴度107TCID50/0.1 ml。1.3操作方法

1.3.1模型的建立及分組: 70小鼠隨機(jī)分為3組。制備柯薩奇B3病毒(CVB3)感染的心肌炎小鼠60只，注射部位常規(guī)消毒后，腹腔注射10-5即100TCID50/0.1 ml CVB3 0.1 ml，其中30只自病毒感染之日并連續(xù)7 d喂食替米沙坦(10 mg/kg，購自美國Sigma-Aldrich公司)作為觀察組;另外30只無藥物干預(yù)的柯薩奇B3病毒(CVB3)感染心肌炎小鼠作為對照組; 10只腹腔注射等量0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液0.1 ml，未感染病毒也無藥物干預(yù)的小鼠作為空白組。1.3.2實(shí)驗(yàn)方法: 3組存活鼠于實(shí)驗(yàn)第7天分別處死，摘眼球取血，3 000 r/min離心20 min，取血清，－20℃冰箱凍存用于待測脂聯(lián)素，腫瘤壞死因子-α (TNF-α)水平。開胸?zé)o菌摘取心臟并沿左心室長軸切開稱重，經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、浸蠟、包埋，切片。1.3.3觀察指標(biāo):①3組小鼠的7 d存活率及一般情況。②組織病理學(xué)檢查:心臟組織固定于10%甲醛緩沖液，心肌常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察心肌病理改變，并參照Rezkalla等［3］方法半定量計(jì)算心肌病理組織學(xué)積分，即每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野中炎性細(xì)胞浸潤及壞死區(qū)域面積與整個(gè)視野面積之比，無病變計(jì)0分，病變面積＜25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。③血清脂聯(lián)素、TNF-α濃度經(jīng)由雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法測定，試劑盒由美國Santa Cruz公司提供，操作按說明進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布的，經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后趨近正態(tài)分布，組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性比較采用Pearson相關(guān)分析及多重線性回歸，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況病毒感染小鼠于感染2 d后逐漸出現(xiàn)表現(xiàn)精神不振，活動(dòng)減少，體溫降低，毛色晦暗無光澤，聳毛脫毛，刺激反應(yīng)淡漠或易激惹，拒食，抽搐; 5～6 d開始出現(xiàn)死亡，第7天死亡數(shù)量5只(其中觀察組1只，對照組4只)，空白組無發(fā)病及死亡。最后納入實(shí)驗(yàn)研究的小鼠為65只。

2.2組織學(xué)檢查

2.2.1小鼠心臟、體重變化:對照組小鼠體重減輕，心臟重量增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1　3組小鼠體重及心臟重量的變化　±s

表1　3組小鼠體重及心臟重量的變化　±s

組別　體重(g)　心臟重量(mg)空白組(n=10)17.3±6.7　92.5±8.4對照組(n=30)　14.3±3.2　110.2±9.9觀察組(n=30)16.2±2.9　95.4±9.6

2.2.2心肌組織病理學(xué)改變:空白組小鼠心肌標(biāo)本，在顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞排列緊密，無炎性細(xì)胞浸潤。對照組小鼠接種病毒后第7天，可見心肌水腫，炎性細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞變性、壞死，心肌纖維被分割成條索狀，有的心肌斷裂。觀察組小鼠治療第7天，心肌炎癥細(xì)胞較對照組明顯減少，可見少量心肌纖維變性，壞死。見圖1～3。

2.32組血清脂聯(lián)素、TNF-α及病理積分比較觀察組血清脂聯(lián)素水平明顯高于對照組，而TNF-α，病理積分均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與空白組相比，觀察組血清脂聯(lián)素，TNF-α，病理積分水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與空白組相比，對照組血清脂聯(lián)素降低，而TNF-α，病理積分水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2　血清脂聯(lián)素、TNF-α、病理積分比較　±s

表2　血清脂聯(lián)素、TNF-α、病理積分比較　±s

注:與對照組比較，*P＜0.05;與空白組比較，#P＜0.05

組別　脂聯(lián)素(μg/ml)　TNF-α(pg/ml)病理積分觀察組(n=30)　8.03±0.09* #　55.9±2.78* #　0.56±0.08*#對照組(n=30)　6.02±0.08#　183.36±2.24#　1.51±0.12#空白組(n=10)7.12±0.08　36.45±3.19　0

3　討論

病毒性心肌炎是由病毒感染所致的、以心肌細(xì)胞變性壞死和間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤及纖維滲出為主要病理變化的一種心血管內(nèi)科常見疾病。病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前對本病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。眾多研究表明神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)亦參與了病毒性心肌炎的病理過程，導(dǎo)致心肌炎心肌重構(gòu)和心功能不全的重要因素。

脂聯(lián)素一種主要由脂肪組織分泌的重要調(diào)節(jié)激素。目前研究提示其與肥胖、糖尿病、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心肌肥厚及心力衰竭等多種內(nèi)分泌及心血管疾病有關(guān)，Saegusa等［4］研究通過分子生物學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)小鼠病毒性心肌炎模型，小鼠心肌能表達(dá)脂聯(lián)素，同時(shí)坎地沙坦可以上調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)，改善病毒性心肌炎的預(yù)后。Kanda等［5］研究發(fā)現(xiàn)限制能量攝入、降低體重可以誘導(dǎo)心肌脂聯(lián)素的表達(dá)、分泌，減輕病毒性心肌炎小鼠的心肌損傷，降低死亡率。說明心肌分泌脂聯(lián)素對心臟有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)對照組血清脂聯(lián)素含量最低，與空白組及觀察組比較有顯著性差異，表明病毒性心肌炎時(shí)血清呈低脂聯(lián)素水平。

圖1　空白組小鼠心肌病理改變(HE×100)

圖2　對照組小鼠心肌病理改變(HE×100)

圖3　觀察組小鼠心肌病理改變(HE×100)

近年來國外研究顯示，替米沙坦是一種特殊結(jié)構(gòu)的血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，能激活PPAR-γ，調(diào)節(jié)血糖代謝，血脂代謝，抗炎、抗氧化，改善胰島素抵抗和動(dòng)脈粥樣硬化。PPAR-γ在調(diào)節(jié)能量代謝、細(xì)胞分化、增殖、凋亡、炎性反應(yīng)、內(nèi)源性活性物質(zhì)合成和分泌中發(fā)揮重要信使作用。研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ激動(dòng)劑可導(dǎo)致腫瘤壞死因子、瘦素、抵抗素合成減少及脂聯(lián)素合成增加; PPAR-γ激動(dòng)劑通過直接通過血管緊張素受體AT1作用于脂聯(lián)素啟動(dòng)子誘導(dǎo)脂聯(lián)素的產(chǎn)生或拮抗TNF-α對脂聯(lián)素啟動(dòng)子的抑制效應(yīng)來阻止胰島素抵抗患者的動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病的發(fā)生。本研究中，與空白組相比，第7天柯薩奇B3病毒(CVB3)感染的心肌炎小鼠對照組脂聯(lián)素水平均明顯降低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，而給予替米沙坦干預(yù)的觀察組小鼠脂聯(lián)素水平較對照組，空白組均明顯升高，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。心肌病理積分與血清脂聯(lián)素水平呈負(fù)相關(guān)性(P＜0.05) ;給予替米沙坦干預(yù)的觀察組小鼠TNF-α，病理積分水平均明顯低于對照組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。從病理組織結(jié)果看，對照組小鼠接種病毒后第7天，可見心肌水腫，炎性細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞變性、壞死等，觀察組心肌炎癥細(xì)胞較對照組明顯減少。提示替米沙坦能夠增加對心臟有保護(hù)作用的脂聯(lián)素表達(dá)，減少TNF-α的分泌，減少心肌損傷。從而，在病毒性心肌炎病理進(jìn)程中發(fā)揮一定的抗炎，抗損傷，逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)，改善心衰的作用。

參考文獻(xiàn)

1Kanda T，Saegusa S，Takahashi T，et al.Reduced-energy diet improves survival of obese KKAy mice with viral myocarditis: induction of cardiac adiponectin expression.Int J Cardiol，2007，119: 310-318.

2Seiichiro S，Yu F，Takashi T，et al.Oral Administration of Candesartan Improves the Survival of Mice with Viral Myocarditis through Modification of Cardiac Adiponectin Expression.Cardiovasc Drugs Ther，2007，21: 155-160.

3Rezkalla S，Kloner RN，Khatib G，et al.Effect of metoprolol on the acute phase of Coxsackievirus B3 murine myocarditis.J Am Coll Cardiol，1988，12: 412-414.

4Saegusa S，F(xiàn)ei Y，Takahashi T，et al.Oral administration of candesartan improves the survival of mice with viral myocarditis through modification of cardiac adiponectin expression.Cardiovasc Drugs Ther，2007，21: 155-160.

5Kanda T，Saegusa S，Takahashi T，et al.Reduced-energy diet improves survival of obese KKAy mice with viral myocarditis: induction of cardiac adiponectin expression.Int J Cardiol，2007，119: 310-318.

Effect of telmisartan on the adiponectin expression in mice with viral myocarditis

WANG Yaling，YANG Rong，JIN Xin， et al.
Department of Cardiology，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China.

【Abstract】Objective To investigate the effect of telmisartan on the expression levels of adiponectin，tumor necrosis factor-α(TNF-α) in mice with viral myocarditis.MethodsThe animal models with viral myocarditis were induced by Coxsackie B3 virus in 60 mice in which 30 mice were given telmisartan by gavage from the day of viral infection for 7 days (observation group )，however，the other 30 mice without drug intervention were served as control group，and the other 10 mice without viral infection and without drug intervention were served as blank control group.The myocardial pathological changes and pathological score were observed，and the levels of serum adiponectin and TNF-αwere detected for three groups by double antibody sandwich enzyme-linked immune method.ResultsThe serum levels of adiponectin in observation group were significantly higher than those of control group，however，the serum levels of TNF-α and pathological score were obviously lower than those in control group (P＜0.05).As compared with those in blank control group，the levels of adiponectin，TNF-α，pathological score in observation group were significantly increased (P＜0.05).As compared with those in blank control group，the serum levels of adiponectin in control group were significantly decreased，however，the levels of TNF-α，pathological score were significantly increased (P＜0.05).The myocardial edema，inflammatory cells infiltration，myocardial cell degeneration and necrosis were found in control group at 7 days after viral infection，however，these changes were obviously.ConclusionTelmisartan can increase the expression levels of adiponectin having protective effects on heart，and can decrease the levels of TNF-α，thus which can relieve myocardial injury.

【Key words】telmisartan; viral myocarditis; adiponectin; tumor necrosis factor alpha

(收稿日期:2014－09－30)

通訊作者:楊蓉，050000河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科; E-mail: yangrong7203@163.com

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.002

【文章編號】1002－7386(2015) 08－1128－03

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【中圖分類號】R 542.211