張磊　趙春香　王瑞剛　賀瑞新　馮凱　石秋艷

卡巴膽堿聯(lián)合膳食纖維對(duì)燙傷休克大鼠血漿內(nèi)毒素和D-乳酸的影響

張磊趙春香王瑞剛賀瑞新馮凱石秋艷

【摘要】目的初步研究卡巴膽堿聯(lián)合膳食纖維對(duì)燙傷大鼠腸屏障的作用。方法以30%TBSAⅢ°燙傷Wistar大鼠為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，隨機(jī)分為0.9%氯化鈉溶液組(A組)、膳食纖維治療組(B組)、卡巴膽堿治療組(C組)、膳食纖維+卡巴膽堿治療組(D組)，分別在傷后6、12、24、48、72 h活殺動(dòng)物，另設(shè)正常組(N組)，取小腸在光鏡下觀察其病理形態(tài)變化，取門靜脈血測(cè)血漿微量內(nèi)毒素的變化，取腹主動(dòng)脈血測(cè)血漿D-乳酸的變化。結(jié)果各燙傷組大鼠腸組織受損程度，血漿內(nèi)毒素、D-乳酸水平明顯高于組(P＜0.05)，傷后12～24 h最顯著，至72 h仍不能恢復(fù);聯(lián)合應(yīng)用卡巴膽堿與膳食纖維，顯著降低了血漿內(nèi)毒素、D-乳酸水平(P＜0.05)。結(jié)論早期聯(lián)用卡巴膽堿與膳食纖維對(duì)燙傷后大鼠腸屏障道有明顯保護(hù)作用，一定程度上優(yōu)于單用卡巴膽堿或膳食纖維的治療效果。

【關(guān)鍵詞】燙傷;血漿內(nèi)毒素; D-乳酸;卡巴膽堿;大鼠

項(xiàng)目來源:河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究與發(fā)展指令性課題(編號(hào): ZL20140187)

作者單位: 063000河北省唐山市，河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院NICU

胃腸道是人體主要消化器官，也是體內(nèi)最大的細(xì)菌儲(chǔ)存器官，容納細(xì)菌數(shù)量高達(dá)1 012個(gè)［1］。正常生理情況下，腸道有著重要的屏障作用，稱之為腸屏障(intestinal barrier)，由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、微生物屏障和免疫屏障等組成。嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒(燙)傷等可造成腸黏膜屏障的損傷、萎縮，腸通透性增加，腸菌群失調(diào)，造成腸屏障破壞或功能障礙，從而導(dǎo)致細(xì)菌和(或)內(nèi)毒素易位，炎癥因子釋放，并可誘發(fā)和(或)加重全身炎癥反應(yīng)和多器官功能障礙［2，3］。隨著研究及臨床實(shí)踐的深入，腸屏障保護(hù)越來越受到重視。本實(shí)驗(yàn)以30%TBSAⅢ°燙傷大鼠為動(dòng)物模型，探討研究卡巴膽堿聯(lián)合膳食纖維對(duì)腸屏障的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1材料清潔級(jí)成年雄性Wistar大鼠，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［合格證號(hào): SCXK-(軍) 2009-003］，稱重并編號(hào)，體重為(300±20) g。復(fù)合膳食纖維購于紐迪希亞(Nutircia，荷蘭)制藥(無錫)有限公司，不可溶性膳食纖維(耐消化淀粉∶纖維素=1∶1)與可溶性膳食纖維(菊粉∶低聚果糖∶阿拉伯膠=1∶1∶1)的比例為3∶1，加水配成濃度為200 g/L的液體?？ò湍憠A購于美國Sigma公司。0.9%氯化鈉溶液購于石家莊四藥集團(tuán)。1.2燙傷模型制備將大鼠隨機(jī)分為正常組(N組)、0.9%氯化鈉溶液組(A組)、膳食纖維治療組(B 組)、卡巴膽堿治療組(C組)、膳食纖維+卡巴膽堿治療組(D組)，A、B、C、D組再分為6、12、24、48、72 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各4只大鼠。N組4只大鼠。術(shù)前12 h禁食，不禁水。用10%水合氯醛溶液(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后用6%硫化鈉脫去大鼠肩部至髖部30% TBSA毛發(fā)［4］。A、B、C、D組大鼠置入97～99℃沸水25 s，制備30% TBSAⅢ°燙傷大鼠［5，6］。傷后各燙傷組立即按Parkland公式以4 ml·kg－1·1%TBSA－1的一半腹腔注射補(bǔ)液。傷后2 h，C、D組大鼠腹腔予以卡巴膽堿(30 μg/kg)。傷后3 h，A組開始予以0.9%氯化鈉溶液灌胃，B、D組開始予以復(fù)合膳食纖維灌胃，復(fù)合膳食纖維量為每天125 ml/kg;均勻分6次給予(4 h 1次)，直至被活殺。期間5組大鼠自由飲水。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1腸道損傷情況:取距回盲部處的小腸組織體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛溶液固定，常規(guī)制片，蘇木素伊紅染色后進(jìn)行組織學(xué)檢查，采用四級(jí)評(píng)分系統(tǒng)對(duì)小腸損傷情況進(jìn)行評(píng)定(0～3分)［7］。0分:無異常改變; 0.5分:腸黏膜水腫、充血，無壞死性病變; 1分:病變局限與腸黏膜有散在性出血點(diǎn); 2分:壞死累及表淺黏膜，黏膜中有多區(qū)域出血; 3分:全層壞死并伴腸腔出血。

1.3.2血漿內(nèi)毒素測(cè)定:所用物品均經(jīng)去熱源處理。嚴(yán)格按無菌操作規(guī)程取門靜脈血1.5 ml，5 000 r/min離心5 min取上層血清，置入－80℃冰箱保存?zhèn)錂z。按照大鼠血漿內(nèi)毒素Elisa試劑盒(購于Bio Swamp公司)使用說明書檢測(cè)。

1.3.3血漿D-乳酸測(cè)定:穿刺腹主動(dòng)脈，取血4～5 ml，5 000 r/min離心5 min，吸取上清液血漿，取上層血清，置入－80℃冰箱保存?zhèn)錂z。按照大鼠血漿D-乳酸Elisa試劑盒(購于Bio Swamp公司)使用說明書檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.15組小腸病理學(xué)標(biāo)本觀察結(jié)果燙傷后，4組大鼠的小腸黏膜出現(xiàn)固有層水腫，中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，部分黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落;腸絨毛橫徑增寬，高度縮短。6 h各燙傷組損傷評(píng)分無明顯差異。12 h各燙傷組損傷最明顯，評(píng)分最高，其中D組評(píng)分較A組差異比較明顯(P＜0.05)。24 h后各燙傷組受損黏膜開始修復(fù)，但各組修復(fù)速度不等，A組評(píng)分仍高于其他燙傷組(P＜0.05)，但B、C、D組之間損傷評(píng)分差異不明顯(P＞0.05)。72 h后腸黏膜損傷較前好轉(zhuǎn)，損傷評(píng)分下降，但仍高于N組(P＜0.05)。見表1。

表1　5組大鼠小腸損傷評(píng)分結(jié)果　n=4，分，±s

表1　5組大鼠小腸損傷評(píng)分結(jié)果　n=4，分，±s

注:與A組比較，*P＜0.05

組別6 h　12 h　24 h　48 h　72 h N組0 A組　0.750±0.289　2.000±0.817　1.500±0.574　1.125±0.629　0.750±0.289 B組　0.625±0.250　1.250±0.500　0.750±0.289*　0.500±0.408*　0.250±0.289* C組　0.750±0.287　1.250±0.500　0.750±0.289*　0.375±0.250*　0.250±0.289* D組　0.750±0.289　1.125±0.629*　0.750±0.289*　0.375±0.250*　0.250±0.289*

2.25組大鼠內(nèi)毒素測(cè)定結(jié)果燙傷后，各燙傷組血漿內(nèi)毒素水平變化趨勢(shì)一致，且各時(shí)間點(diǎn)均與正常組有非常顯著差異(P＜0.01)。6 h后各燙傷組內(nèi)毒素水平已較N組有明顯差異性(P＜0.01)，但各燙傷組間差異性不大(P＞0.05)。12 h后各燙傷組血漿內(nèi)毒素水平較前升高，其中D組血漿內(nèi)毒素水平低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ; B、C組與A組相比，差異性不明顯(P＞0.05)。24 h后各燙傷組血漿內(nèi)毒素水平升至最高水平，但B、C、D組內(nèi)毒素水平均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) ; B、C組內(nèi)毒素水平均高于D組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。48 h后各燙傷組血漿內(nèi)毒素水平較24 h后有明顯下降，但A組內(nèi)毒素水平仍高于其他燙傷組，D組與A組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ; B組與C組無明顯差異(P＞0.05)。72 h后各燙傷組內(nèi)毒素水平降至最低水平，但仍高于N組(P＜0.05) ; B、C、D組內(nèi)毒素水平均低于A組(P＜0.05或＜0.01) ;另外D組水平明顯低于B、C組(P＜0.05或＜0.01)。見表2。

表2　5組大鼠內(nèi)毒素水平比較　n=4，EU/L±s

表2　5組大鼠內(nèi)毒素水平比較　n=4，EU/L±s

注:與N組比較，*P＜0.01;與A組比較，#P＜0.05，△P＜0.01;與B組比較，☆P＜0.05;與C組比較，▲P＜0.05

組別6 h　12 h　24 h　48 h　72 h N組0.028±0.011 A組　0.091±0.009*　0.534±0.016*　0.706±0.083*　0.368±0.104*　0.136±0.021*# B組　0.098±0.021*　0.518±0.024*　0.602±0.033* #　0.276±0.028* #　0.107±0.019* #C組　0.086±0.007*　0.511±0.026*　0.599±0.028* #　0.266±0.013* #　0.110±0.008* #D組　0.093±0.018*　0.493±0.021* #　0.516±0.032＊△☆▲　0.226±0.020＊△☆▲　0.073±0.020＊△☆▲

2.35組大鼠血漿D-乳酸測(cè)定結(jié)果血漿D-乳酸含量在燙傷后各時(shí)間點(diǎn)與N組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，燙傷6 h后4組大鼠血漿D-乳酸水平已明顯高于正常組(P＜0.05)，12 h后達(dá)到峰值，24 h后較前下降，72 h后降至最低。4組隨時(shí)間的變化趨勢(shì)一致。燙傷6h后4組大鼠之間血漿D-乳酸水平差異不明顯(P＞0.05)。12 h后4組比較，D組D-乳酸水平明顯低于A組(P＜0.05)，但A、B、C組之間無明顯差異(P＞0.05)。24 h后D組血漿D-乳酸水平與B組或C組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 48 h后D組血漿D-乳酸水平明顯低于B組(P＜0.05)，但與C組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。72 h后B、C、D組D-乳酸水平均低于A組(P＜0.01)。見表3。

表3　5組大鼠血漿D-乳酸水平比較　n=4，μg/L，±s

表3　5組大鼠血漿D-乳酸水平比較　n=4，μg/L，±s

注:與N組比較，*P＜0.05;與A組比較，#P＜0.05，△P＜0.01;與B組比較，☆P＜0.05，▲P＜0.01;與C組比較，★P＜0.01

組別6 h　12 h　24 h　48 h　72 h N組22.210±5.088 A組　111.863±20.191*　162.108±11.601*　131.567±8.124*　88.218±4.959*　70.485±6.730*B組　119.745±19.406*　148.316±17.476*　123.686±4.959*　80.337±10.364*　51.766±3.218＊△C組　120.730±10.426*　139.449±25.208*　122.700±8.513*　78.366±13.021*　51.766±3.218＊△D組　103.982±15.557*　134.523±8.513* #　103.982±13.412＊△▲★　64.574±13.021＊△☆　46.840±3.773＊△

3　討論

腸缺血-再灌流是燒(創(chuàng))傷后最常見的病理生理過程。腸上皮細(xì)胞是腸屏障的重要組成部分，對(duì)缺血、缺氧十分敏感。缺血、缺氧可引起腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能的改變，導(dǎo)致腸屏障功能障礙，引起細(xì)菌和內(nèi)毒素的移位，與膿毒癥和MODS的發(fā)生有密切關(guān)系，是機(jī)體遭受“二次打擊”的來源［8，9］。這一觀點(diǎn)已經(jīng)被絕大多數(shù)同業(yè)人員所接受。如何減輕機(jī)體創(chuàng)傷后腸屏障的損害，減少細(xì)菌和內(nèi)毒素移位，一直是關(guān)于防治膿毒癥和MODS研究的重要課題。

膳食纖維［10，11］是指能抗人體小腸消化吸收而能在大腸部分或全部發(fā)酵可食用植物性成分、碳水化合物及其相類似物質(zhì)總稱。早期研究證實(shí)，膳食纖維是消化過程中所需要的重要營養(yǎng)素，能夠促進(jìn)腸蠕動(dòng)，抑制腸道細(xì)菌的生長，調(diào)節(jié)腸道菌群的生態(tài)平衡，有助于維護(hù)腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性，降低腸道通透性，對(duì)腸黏膜有明顯營養(yǎng)和保護(hù)作用［12］。

卡巴膽堿(Carbachol)是一種膽堿能受體激動(dòng)藥，能同時(shí)興奮膽堿能M受體和N受體，其興奮M受體可促進(jìn)胃腸動(dòng)力，擴(kuò)張血管;興奮N受體與膽堿能抗炎通路有關(guān)。相關(guān)研究表明，卡巴膽堿既能改善腸道微循環(huán)，擴(kuò)張血管增加腸黏膜血流量，又能夠顯著降低腸缺血-再灌注損傷后腸組織炎性反應(yīng)，減少炎性因子釋放，減輕腸缺血-再灌注時(shí)腸上皮細(xì)胞的損害，從而起到保護(hù)腸屏障功能［13］。

我們?cè)O(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)以研究在燒傷早期聯(lián)合應(yīng)用復(fù)合膳食纖維與卡巴膽堿對(duì)腸屏障的保護(hù)作用，并比較聯(lián)合應(yīng)用的治療效果與單獨(dú)應(yīng)用卡巴膽堿或膳食纖維時(shí)的治療效果。本實(shí)驗(yàn)以30%TBSAⅢ°燙傷Wistar大鼠為動(dòng)物模型。目前檢測(cè)腸屏障損傷的指標(biāo)有多種，在本實(shí)驗(yàn)中我們選擇的是光鏡下的腸結(jié)構(gòu)變化和血漿內(nèi)毒素、D-乳酸的水平變化，其中以血漿內(nèi)毒素變化敏感性最高。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在燙傷早期，各燙傷組大鼠腸損傷評(píng)分、血漿內(nèi)毒素、D-乳酸水平均較正常組大鼠顯著升高，提示30% TBSAⅢ°燙傷導(dǎo)致大鼠腸道屏障受損［14］。以腸損傷評(píng)分作為參考來比較，燙傷12 h后，卡巴膽堿與膳食纖維聯(lián)用時(shí)，腸損傷評(píng)分低于對(duì)照組，表現(xiàn)出對(duì)腸道的保護(hù)，而單用卡巴膽堿或膳食纖維未表現(xiàn)出保護(hù)作用，表明二者聯(lián)用對(duì)腸屏障保護(hù)啟動(dòng)時(shí)間較早;但在24 h后各時(shí)間點(diǎn)比較，單用卡巴膽堿或膳食纖維與二者聯(lián)用均對(duì)腸道有保護(hù)作用，3組差別不明顯。以血漿內(nèi)毒素水平作為參考來看，卡巴膽堿聯(lián)合膳食纖維在燙傷12 h后已表現(xiàn)出對(duì)腸屏障的保護(hù);燙傷24 h以后，單用或者聯(lián)合應(yīng)用均對(duì)腸屏障有明顯保護(hù)作用，但從B、C、D組內(nèi)毒素水平差異來看，卡巴膽堿聯(lián)合膳食纖維對(duì)腸道的保護(hù)要優(yōu)于單用卡巴膽堿或膳食纖維。從各組D-乳酸水平變化來看，亦可看出卡巴膽堿聯(lián)合膳食纖維對(duì)腸道的保護(hù)啟動(dòng)較快，在12 h后即表現(xiàn)出對(duì)腸道的保護(hù)作用;燙傷24 h后卡巴膽堿聯(lián)合膳食纖維對(duì)腸道保護(hù)作用強(qiáng)于單用卡巴膽堿或膳食纖維，但在創(chuàng)傷后期各治療組之間無明顯區(qū)別。由此可見，早期聯(lián)合應(yīng)用卡巴膽堿與膳食纖維對(duì)燙傷后大鼠腸屏障道有明顯保護(hù)作用，啟動(dòng)時(shí)間較早，優(yōu)于單用卡巴膽堿或膳食纖維的治療效果。

經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外尚未見有與本研究相似的研究報(bào)告。本研究僅是初步的，存在樣本量小等問題，仍須做進(jìn)一步的動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究探討。

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Effect of carbachol combined with dietary fiber on the levels of plasma endotoxin and D-lactic acid in rats with scald

ZHANG Lei，ZHAO Chunxiang，WANG Ruigang，et al.
Hebei United University，Hebei，Tangshan 063000，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate initially the effect of carbachol combined with dietary fiber on the intestinal barrier in rats with scald.Methods The animal models were established in Wistar rats by 30% TBSAⅢ°scald，and the model rats were randomly divided into four groups: physiological saline group (Group A)，dietary fiber treatment group (Group B)，carbachol treatment group (Group C)，carbachol plus dietary fiber treatment group (Group D).Meanwhile normal control group was set up.These rats were sacrificed at 6，12，24，48 and 72 hours after scald.The pathological changes in small intestine were observed under light microscope，and portal vein blood specimens were taken to detect the levels of plasma endotoxin，and abdominal aorta blood specimens were taken to detect the contents of plasma D-lactic acid.Results The injury degree in small intestine，the plasma levels of endotoxin and D-lactic acid in scald groups were significantly higher than those in normal control group (P＜0.05)，which peaked at 12～24h after scald，moreover，which could not recover to normal levels until 72 hours after the injury.The combined application of carbachol with dietary fiber could obviously decrease the plasma levels of endotoxin and D-lactic acid (P＜0.05).ConclusionEarly combined application of carbachol with dietary fiber has obvious protective effects on intestinal barrier in rats with scald，which is superior to simple application of carbachol or dietary fiber.

【Key words】scald; endotoxin; plasma D-lactic acid; carbachol; rats

(收稿日期:2014－10－17)

通訊作者:王瑞剛，063000河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院NICU; E-mail: wangrg123@ tom.com

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.001

【文章編號(hào)】1002－7386(2015) 08－1125－04

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】R 644