崔 婧 ，時(shí)東方，王 強(qiáng)，陳麗娜，陳 珊

(1.長春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130032；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130024)

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一株聚乳酸降解菌的鑒定

崔 婧1,2，時(shí)東方1，王 強(qiáng)1，陳麗娜1，陳 珊2

(1.長春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130032；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130024)

本文從活性污泥中篩選到一株可以降解PLA的細(xì)菌DS04—W，通過形態(tài)學(xué)、生理生化性質(zhì)以及16SrDNA序列分析進(jìn)行菌種鑒定，初步鑒定該菌為Bacillus megaterium(巨大芽孢桿菌)，并且具有降解PLA的能力，這為進(jìn)一步研究酶解PLA的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

聚乳酸 ；巨大芽孢桿菌；鑒定

全球經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展的今天，對(duì)塑料制品的需求在不斷增加，但是一般塑料制品在自然界中很難被降解，所以造成現(xiàn)在“白色污染”越來越嚴(yán)重,破壞了生態(tài)平衡，嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。近年來人們開始關(guān)注可降解塑料,目前已開發(fā)的生物可降解塑料主要是聚酯類材料，其中聚乳酸(PLA)以良好的物理化學(xué)性能、機(jī)械性能及生物相容性受到廣泛關(guān)注[2]。雖然PLA在很多物理性能和機(jī)械性能上優(yōu)于其他聚酯類材料，但是自然界中發(fā)現(xiàn)的能夠降解PLA的微生物數(shù)量很少，不到0.04%[3-5]。目前為止，人們分離得到能夠降解PLA的菌株只有幾十種，絕大部分都屬于放線菌，包括Amycolatopsis屬[6-8]、Saccharothrixwaywayandensis屬[9]和Kibdelosporangiumaridum屬[10]等，只有少量細(xì)菌和真菌可以降解PLA。本實(shí)驗(yàn)是從自然界中篩選出一株可以降解PLA的細(xì)菌，通過形態(tài)學(xué)、生理生化性質(zhì)以及16SrDNA序列分析進(jìn)行菌種鑒定，并研究其降解PLA的能力，這為進(jìn)一步研究細(xì)菌降解PLA的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 聚乳酸(PLA)材料

PLA膜和PLA粉末由中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所提供，相對(duì)分子量2.074 105。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)基本培養(yǎng)基 NaCl 0.1g·L-1，CaCl2·2H2O 0.02g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g·L-1，酵母提取物 0.25g·L-1，(NH4)2SO41g·L-1， MgSO4·7H2O 0.2g·L-1，MnSO40.5mg·L-1， Na2WO40.5mg·L-1， Na2MoO4·2H2O 0.5mg·L-1， pH=8.0。

(2)PLA培養(yǎng)基 10ml氯仿中加入0.1gPLA粉末，溶解后，加入0.01g Plysurf A210G和 100ml基本培養(yǎng)基?；靹蚝笥贸暡?xì)胞破碎儀處理，工作時(shí)間7s，間隔時(shí)間6s，處理50次。處理后，將乳化液放在磁力攪拌器上,60℃加熱90分鐘，蒸去氯仿，最后用基本培養(yǎng)基定容到100ml，得到PLA培養(yǎng)基[12]。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離純化

取10g活性污泥,接入到以PLA為唯一C源的100ml富集培養(yǎng)基中，在37℃下?lián)u床培養(yǎng)，取1ml的培養(yǎng)液稀釋涂布于PLA固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分離純化。

1.2.2 降解PLA膜實(shí)驗(yàn)

將PLA膜(1.0cm×1.0cm)滅菌，再放入滅菌的100ml基本培養(yǎng)基中；接入一定量的菌液，在37℃，150r·min-1條件下培養(yǎng)3d。

1.2.3 菌種鑒定

根據(jù)《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化特性的鑒定[11]。

菌株16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析：將細(xì)菌的基因組DNA提取，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化，測序工作由上海生物工程有限公司完成。將菌株的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，使用MEGA 3.1軟件來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 PLA降解酶活力的測定

取0.1g·ml-1的PLA乳化液1m,與等體積粗酶液混合，37℃保溫24h，然后用L—乳酸試劑盒(南京建成)測定上清中乳酸含量。PLA降解生成乳酸，所以通過計(jì)算乳酸生成量來說明PLA降解酶的活力。同時(shí)與滅活的酶液做對(duì)照[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離純化與PLA膜降解能力的測定

從活性污泥中篩選到一株能降解PLA的菌株，命名為DS04—W。該菌對(duì)PLA膜具有降解作用，通過掃描電鏡觀察PLA膜，發(fā)現(xiàn)在降解前后PLA膜有顯著不同，降解后PLA膜表面凹凸不平，膜上有裂紋出現(xiàn)，透明度下降,并且可以觀察到膜的表面有菌生長。

A.PLA膜降解前1000× B.PLA膜降解后2000×

2.2 PLA降解菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

顯微鏡下觀察菌體成短桿狀、有芽孢、革蘭氏染色為陰性，菌落成透明、圓形、表面光滑隆起狀(圖2)。

圖2 DS04-W菌株的形態(tài)觀察

2.2.2 生理生化特征

參照《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》結(jié)果，如表1所示。

表1 DS04-W的生理生化性質(zhì)

注：“-”表示結(jié)果為陰性；“+”表示結(jié)果為陽性。

2.2.3 16S rDNA 基因序列分析

對(duì)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增和測定，得到1514bp核苷酸序列。進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與Bacillus sp. 19497和BacillusmegateriumTS IW36 的16S rDNA的同源性為99%。對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。

圖3 DS04-W 的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

從活性污泥中篩選到一株可以降解PLA的菌株DS04-W，用掃描電鏡觀察其降解PLA膜的能力，發(fā)現(xiàn)降解前后PLA膜有顯著變化，證實(shí)菌株確實(shí)對(duì)PLA具有降解能力。

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,從形態(tài)學(xué)和生理生化性質(zhì)上進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)菌株屬于芽孢桿菌屬，結(jié)合16S rDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)與Bacillus sp. 19497和Bacillus megaterium TS IW36的同源性為99%，因此鑒定菌株DS04-W是Bacillus megaterium(巨大芽孢桿菌)。

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Identification of Poly (L-lactic acid) Degrading Microorganism

CUI Jing1,2, SHI Dong-fang1, WANG Qiang1, CHEN Li-na1,CHEN Shan2

(1.Changchun Normal University, Changchun Jilin 130032,China;2.Life Sciences of Northeast University, Changchun Jilin 130024, China)

A strain possessing activity to degrade poly-L-lactic acid (PLA) DS04-W was screened from sludge．It was identified by the analyses of morphological, physiological and biochemical properties, 16SrDNA comparison. It was identified as Bacillus megaterium.Strains DS04′ - W has the ability of degradation PLA. It established the foundation for the further research on enzymic hydrolysis PLA.

Poly (L-lactic acid); Bacillus megaterium;identification

2015-06-27

崔 婧(1986- )，女，吉林長春人，長春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

Q93-331

A

2095-7602(2015)10-0062-04