李新星，于奇，田羽，張健，刁宏宇，劉云會

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 神經(jīng)外科，遼寧 沈陽110004）

膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，約占成人顱內(nèi)腫瘤的35%～61%，其中超過60%的膠質(zhì)瘤呈現(xiàn)惡性表達(dá)。盡管采用先進(jìn)的手術(shù)、化療、放療等綜合治療手段，療效仍不理想。因此研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找新的基因治療手段已迫在眉睫。目前，從分子生物學(xué)方面抑制膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展已成為新的可行方法。Micro RNAs（miRNAs）是長度為21～25核苷酸的短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的單鏈小分子RNA，microRNA-221（miR-221）轉(zhuǎn)錄后通過促進(jìn)靶mRNA的降解和/或抑制翻譯而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)作用[1]。近年來有研究表明，miR-221在黑色素瘤[2]、乳腺癌[3]以及前列腺癌等[4]多種腫瘤中出現(xiàn)過表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究旨在探討miR-221在膠質(zhì)瘤中表達(dá)和預(yù)后價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月1日-2014年7月31日在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科診斷為膠質(zhì)瘤患者45例，男性30例，女性15例。所有患者經(jīng)病理檢查證實。收集并分析所有患者的腫瘤組織及瘤組織旁正常組織樣本，其中低級別膠質(zhì)瘤13例，高級別膠質(zhì)瘤32例。既往有免疫系統(tǒng)疾病及其他系統(tǒng)癌癥病史患者均被排除。所有參與患者在研究前都知情同意，研究方案由中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑與方法

總RNA按照miRNeasy小型試劑盒（加拿大Qiagen公司）說明書從樣本中提取，通過Nano DropTM1000分光光度計（美國Nano Drop公司）提取RNA在260/280（RNA/DNA）和260/230（RNA/Protein）處的吸光度以確定其濃度。所有的樣本置入-80℃冰箱冷凍保存。用TaqManRMicro RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Applied Biosystems公司生產(chǎn)）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。5μl混合體系包含0.5μl不同引物，0.05μl的100 mmol dTNPs，0.5μl的10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.063μl的20 u/μl RNA酶抑制劑，0.330μl的50 u/μl Multiscribe逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA樣品以及去RNA酶水用于cDNA合成。根據(jù)RNA的濃度來確定其體積并使得最終反應(yīng)的體積歸一化。

定量PCR的反應(yīng)體系包含2μl cDNA、5μl TaqManR2×Perfect Master Mix、0.25μl針對不同miRNA的特異引物以及2.75μl去RNA酶水，使總體積為10μl。在Bio-Rad IQ5（美國Bio-Rad Laboratories公司）熱循環(huán)儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。以U6 snRNA（美國Ambion公司）作為內(nèi)參，反應(yīng)體系中包含U6的特異性引物。PCR擴(kuò)增的步驟如下：95℃預(yù)變性3min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)，置于4℃冰箱保存。根據(jù)Bio-Rad iQ5 2.1標(biāo)準(zhǔn)版光學(xué)系統(tǒng)軟件讀取的循環(huán)閾值（threshold cycle，Ct）來確定miRNA的表達(dá)程度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Stata 12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用t檢驗來評估m(xù)iR-221在膠質(zhì)瘤組織和瘤組織旁正常對照組中的表達(dá)差異；建立受試者工作特征（receiveroperating characteristic，ROC）曲線，計算ROC曲線下面積（area under the curves，AUC）來評估m(xù)iR-221在膠質(zhì)瘤組織和瘤組織旁正常組織中表達(dá)水平的差異；約登指數(shù)篩選最佳臨界值；采用Logistic回歸分析評估標(biāo)記物與膠質(zhì)瘤的相關(guān)性；依據(jù)隨訪數(shù)據(jù)利用Kaplan-Meier法對膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行生存分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

收集并分析所有患者的膠質(zhì)瘤組織及瘤組織旁正常組織樣本。miR-221在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著升高（P=0.000）（見圖1）；進(jìn)一步通過ROC分析和AUC值驗證miR-221在膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)水平顯著高于正常組織。ROC曲線顯示，miR-221區(qū)分腫瘤組織的表達(dá)水平有效值（AUC=0.74，95%CI：0.63和0.84）（見圖2）。miR-221的最佳臨界值為2.17，敏感性為0.73，特異性為0.69。

圖1 m iR-221在膠質(zhì)瘤組織和瘤旁非腫瘤組織中的表達(dá)水平比較

圖2 m iR-221在膠質(zhì)瘤組織和瘤組織旁非腫瘤組織中的ROC曲線分析

為進(jìn)一步研究miR-221的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的發(fā)展和患者臨床特征的關(guān)系，所有參與的患者根據(jù)性別、年齡、腫瘤大小和分化程度進(jìn)行分類。通過t檢驗和單因素方差分析評估m(xù)iR-221在不同組中的表達(dá)。結(jié)果表明，miR-221的表達(dá)與患者的性別及年齡無明顯相關(guān)。隨著膠質(zhì)瘤病理級別的升高，miR-221表達(dá)水平出現(xiàn)顯著上調(diào)（P=0.049）；然而miR-221的表達(dá)與腫瘤大小無明顯相關(guān)（P=0.060）。見附表。

對45例患者進(jìn)行術(shù)后隨訪，直至死亡或至2014年7月31日。依據(jù)隨訪數(shù)據(jù)利用Kaplan-Meier法對膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行生存分析，確定miR-221的預(yù)后價值。根據(jù)miR-221表達(dá)程度對樣本分組，并用Logrank檢驗分析統(tǒng)計學(xué)意義。高表達(dá)是指miR-221表達(dá)水平高于平均水平，反之亦然。miR-221高表達(dá)的患者具有較差的預(yù)后（HR=2.18，95%CI：1.02和4.65，P=0.044）。見圖3。

附表 不同臨床特征患者的m iR-221表達(dá)比較 （±s）

附表 不同臨床特征患者的m iR-221表達(dá)比較 （±s）

注：1）t檢驗；2）單因素方差分析

臨床特征 例數(shù) miR-221的表達(dá) P值性別女15 3.25±0.76 0.4121）男30 3.56±1.34年齡/歲<50 18 3.76±1.12 0.2791）≥50 27 3.34±1.34直徑/cm≥5 14 3.95±1.45 0.0602）3～5 12 3.35±1.12<3 19 2.97±0.85分化低級別 13 3.84±0.56 0.0491）高級別 32 3.32±0.85

圖3 m iR-125b高低表達(dá)組膠質(zhì)瘤患者的K-W 曲線

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，預(yù)后差。膠質(zhì)瘤的5年生存率<3%，僅次于胰腺癌和肺癌。因此，研究膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后的新型生物標(biāo)記物具有極其重要的意義。miRNA定位于腫瘤中會發(fā)生改變的染色體區(qū)域，miRNA的遺傳變異、擴(kuò)增、缺失或基因沉默都可能引起特定的腫瘤發(fā)生或者提高個體的腫瘤易感性[5]。因而，檢測腫瘤組織中特定miRNA的表達(dá)對于腫瘤的早期診斷、病理分型分級、預(yù)后判斷等具有重大意義。本研究發(fā)現(xiàn)miR-221在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)，而且隨著腫瘤病理級別的升高，miR-221表達(dá)水平出現(xiàn)顯著上調(diào)。

miRNA證實與癌變過程的多個方面相關(guān)。miRNA通過靶向某些基因，不僅參與細(xì)胞周期進(jìn)程及增殖的調(diào)控，也能參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控。研究還發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤抗化療和放療的機(jī)制中起重要作用。MEDINA等[6]研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-221會干擾生長因子信號途徑，刺激細(xì)胞增殖。p27kip1是一種調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞分裂的重要基因，其異常表達(dá)將影響細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。ZHANG等[7]發(fā)現(xiàn)，miR-221是抑癌基因p27Kip1的調(diào)控因子，能在體內(nèi)及體外減弱p27 Kip1的表達(dá)，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。這些數(shù)據(jù)都證明miR-221在細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖及侵襲的調(diào)控中具有重要作用。miR-221的過表達(dá)會激活A(yù)kt途徑，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤的惡性表型[8]。miR-221也能抑制細(xì)胞凋亡，PUMA是2001年報道的Bcl-2家族新成員，因其可被p53快速誘導(dǎo)并具有強(qiáng)大的促凋亡作用而得名。miR-221能靶向抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞促凋亡基因PUMA的表達(dá)[9]。在膠質(zhì)瘤的發(fā)生過程中，過表達(dá)miR-221會誘導(dǎo)酪氨酸蛋白激酶μ（PTPμ）的表達(dá)下調(diào)，PTPμ 能調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移參與癌變過程[10]。miR-221靶向相關(guān)基因，通過PTEN和PI3-K/Akt通路調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其對Connexin43的調(diào)節(jié)也被認(rèn)為與膠質(zhì)瘤有關(guān)[11-12]。此外，miR-221的過表達(dá)可能使膠質(zhì)瘤細(xì)胞對化療和放療的敏感性產(chǎn)生影響，下調(diào)miR-221的表達(dá)可以提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替莫唑胺的敏感性[13]。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）能夠修補(bǔ)替莫唑胺化療引起的DNA損傷，而下調(diào)miR-221的表達(dá)能減少MGMT的表達(dá)，令細(xì)胞無法修復(fù)DNA損傷，并促進(jìn)替莫唑胺介導(dǎo)的細(xì)胞死亡[14]。研究表明，miR-221在放療過程中亦起重要作用，miR-221能在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中激活，而且不依賴PTEN的Akt途徑，下調(diào)miR-221的表達(dá)后可顯著提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性[15]。本研究結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后與miR-221表達(dá)水平顯著相關(guān)，預(yù)后效果較差的患者具有更高的miR-221表達(dá)水平，這可能與膠質(zhì)瘤細(xì)胞對放療和化療的敏感程度有關(guān)。miR-221高表達(dá)的患者對治療的敏感性較低，可能造成較差的預(yù)后效果。

目前，已發(fā)現(xiàn)許多與膠質(zhì)瘤相關(guān)的miRNA，但能反映膠質(zhì)瘤生物學(xué)特征的特異性miRNA表達(dá)譜仍不明確。本研究表明，miR-221在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，而且與膠質(zhì)瘤的病理級別呈正相關(guān)。隨著對miRNA-221的進(jìn)一步研究，有利于更加深入了解miRNA-221在膠質(zhì)瘤病程中的作用，推動miRNA-221成為膠質(zhì)瘤診斷、病理分型、預(yù)后判斷的新的分子生物學(xué)標(biāo)記物，進(jìn)一步使其成為可能的藥物靶點，從而實現(xiàn)miRNA-221對膠質(zhì)瘤的診斷和個性化治療。

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