王剛，解寒冰，戚文濤，董梁

（1.鄭州人民醫(yī)院 急診科，河南 鄭州450000；2.鄭州人民醫(yī)院 普通外科，河南 鄭州450000）

膽管癌是一種原發(fā)于左右肝管至膽總管下端的肝外膽管上皮的惡性腫瘤，占所有消化道腫瘤的3.0%[1]，占肝膽惡性腫瘤的10.0%～20.0%[2]，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。膽管癌早期發(fā)現(xiàn)率低，轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，手術(shù)切除是唯一有效地治療方法[3-4]，手術(shù)切除率為32.0%～51.0%。根治性手術(shù)后，膽管癌患者的3年生存率為40.0%～60.0%[5]，5年生存率低于20.0%[6]。絕大多數(shù)膽管癌患者術(shù)后易于復(fù)發(fā)，未見轉(zhuǎn)移者手術(shù)切除后，3年復(fù)發(fā)率13.3%，5年復(fù)發(fā)率為71.4%；肝區(qū)轉(zhuǎn)移者手術(shù)切除后，3年復(fù)發(fā)率73.9%，5年復(fù)發(fā)率為100.0%，復(fù)發(fā)的主要原因?yàn)楦渭案伍T轉(zhuǎn)移[7]。因此，抑制膽管癌的侵襲轉(zhuǎn)移是膽管癌防治以及改善預(yù)后的重要環(huán)節(jié)。Src基因是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的有內(nèi)在絡(luò)氨酸活性的癌基因，其表達(dá)的Src激酶是一種不需要受體的膜相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激酶[8]，且該Src激酶的表達(dá)水平和腫瘤的高侵襲性和不良預(yù)后密切相關(guān)[9]。因此，越來(lái)越多的研究把Src激酶被作為惡性腫瘤中抗腫瘤藥物的一個(gè)作用靶點(diǎn)，將Src激酶抑制劑用于預(yù)防和治療惡性腫瘤[10]。但是，截至目前，Src激酶在膽管癌中的研究卻是非常有限，本研究旨在探討Src激酶特異性抑制劑PP2對(duì)人膽管癌QBC939細(xì)胞侵襲能力的影響和機(jī)制，為應(yīng)用Src激酶抑制劑治療膽管癌、改善患者預(yù)后提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人膽管癌QBC939細(xì)胞株購(gòu)自上海欣然科技發(fā)展有限公司

1.1.2 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FCS）、青霉素-鏈霉素（P-S雙抗）等均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，使用前按照89∶10∶1比例配制成完全1640培養(yǎng)液；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Costar公司；Src激酶特異性抑制劑PP2購(gòu)自Sigma公司；兔抗人磷酸化Src（p-Src） 單克隆抗體（Tyr416）購(gòu)自Millipore公司產(chǎn)品；鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Transwell侵襲小室（8 pm孔徑）購(gòu)自Millipore公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；mRNA抽提試劑盒miRNeasy Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverAidTM First Strand Cdna Synthesis Kit購(gòu) 自Thermo公 司；RT-PCR 試 劑 盒FastvStart Universal SYBR Green Master Kit購(gòu)自羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人膽管癌QBC939細(xì)胞購(gòu)自上海欣然科技發(fā)展有限公司，用含10%胎牛血清和P-S雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、二氧化碳CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；常規(guī)更換培養(yǎng)液，胰酶消化傳代，所有實(shí)驗(yàn)均采用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 依據(jù)文獻(xiàn)，本課題實(shí)驗(yàn)設(shè)4組，A1組：對(duì)照組（不做處理）；A2組、A3組、A4組（PP2組：分別用2.5、5.0和10.0μmol/L的Src激酶特異性抑制劑PP2處理），各組均為6×3=18次/個(gè)觀測(cè)樣本，即每組樣本>6，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 PP2溶液的配制 Src激酶特異性抑制劑PP2購(gòu)于Sigma公司，溶解度為20mg/ml，溶劑為DMSO，將其配制成飽和溶液，隨后用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液稀釋獲得50μmol/L的濃度，使用時(shí)根據(jù)需要再稀釋獲得不同濃度的工作液。

1.2.4 W estern Blot技術(shù)檢測(cè)PP2對(duì)QBC939細(xì)胞Src激酶磷酸化的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膽管癌QBC939細(xì)胞分別用2.5、5.0和10.0μmol/L濃度的PP2處理48 h后，收集細(xì)胞、裂解、提取蛋白，并以BCA法測(cè)定細(xì)胞裂解蛋白含量。取80μg蛋白樣品行SDS-PAGE分離蛋白，隨后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原，加入1∶500稀釋的兔抗人磷酸化Src（p-Src）單克隆抗體（Tyr 416），1∶200稀釋的鼠抗人β-actin單克隆抗體作為內(nèi)對(duì)照，4℃反應(yīng)過夜，用含0.1%Tween 20的TBS洗膜，再加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下反應(yīng)1 h，洗膜后DAB顯色，將條帶結(jié)果進(jìn)行掃描。

1.2.5 人膽管癌QBC939細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn) 用50mg/L基質(zhì)膠1∶4稀釋液包被8/μm孔徑Transwell小室濾膜的上表面，于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中溫育1 h，用L-15水化小室濾膜上、下表面。消化收集細(xì)胞，離心棄去培養(yǎng)液。用PBS洗1～2遍，用含0.1% BSA的L-15培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/ml的細(xì)胞懸液。24孔板中放置Transwell侵襲小室，先在小室上層分別加入事先制備好的4組細(xì)胞懸液200μl，輕輕搖勻，再向下室加入600μl含10%FBS的L-15培養(yǎng)液。置24孔板于37℃、無(wú)二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后從孔板中移出小室，用脫脂棉拭去小室濾膜上層未通過微孔的細(xì)胞，將此濾膜先于4%多聚甲醛中固定30 min，1%結(jié)晶紫染色10min，使侵襲到濾膜下層的細(xì)胞充分著色呈紫藍(lán)色，輕輕洗滌殘余染料，倒置顯微鏡觀察，每組隨機(jī)選擇6個(gè)視野，計(jì)數(shù)。并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6 PCR技術(shù)檢測(cè)PP2對(duì)QBC939細(xì)胞中侵襲相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膽管癌QBC939細(xì)胞經(jīng)PP2處理48 h后，收集細(xì)胞，提RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取各組cDNA，用ddH2O稀釋50倍。按要求加入試劑cDNA、正義引物，反義引物和ROX。上機(jī)，按20μl體系，設(shè)定以下循環(huán)：①50℃，2 min；②95℃，10 min；③95℃，15 s；④60℃，1min；⑤重復(fù)第③④步；⑥95℃，15 s；⑦60℃，30 s；⑧95℃，15 s。上樣檢測(cè)。

1.2.7 W estern Blot技術(shù)檢測(cè)PP2對(duì)QBC939細(xì)胞中侵襲相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膽管癌QBC939細(xì)胞經(jīng)PP2處理48 h后，收集細(xì)胞、裂解、提取蛋白，并以BCA法測(cè)定細(xì)胞裂解蛋白含量取80μg蛋白質(zhì)，12%SDS-PAGE法進(jìn)行分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原，分別加入稀釋后的鼠抗人E-cadherin和CD44一抗，1∶200稀釋的鼠抗人β-actin單克隆抗體作為內(nèi)對(duì)照，4℃反應(yīng)過夜，用含0.1%Tween 20的TBS洗膜，再加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下反應(yīng)1 h，洗膜后DAB顯色，將條帶結(jié)果進(jìn)行掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)觀測(cè)數(shù)據(jù)主要為計(jì)量數(shù)據(jù)，文中以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。通過正態(tài)性檢驗(yàn)的資料。多組間的整體比較為單因素方差分析，兩兩組間的多重比較為L(zhǎng)SD法和HSD法，兩法比較結(jié)果互為參考。部分試驗(yàn)資料為輕微偏態(tài)且方差不齊同，采用1+LOG轉(zhuǎn)換，而后行單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Src激酶特異性抑制劑PP2抑制p-Src的表達(dá)

經(jīng)Src激酶抑制劑PP2處理后，用Western Blot技術(shù)檢測(cè)Src磷酸化水平，結(jié)果顯示，PP2組中p-Src蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。結(jié)果提示，Src激酶抑制劑PP2能有效抑制Src激酶的活性。見圖1。

2.2 Src激酶特異性抑制劑PP2對(duì)QBC939細(xì)胞侵襲能力的影響

經(jīng)Src激酶抑制劑PP2處理后，用Transwell小室法檢測(cè)QBC939細(xì)胞的體外侵襲能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PP2組穿過小室的細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組的（38.33±9.67）個(gè)，經(jīng)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)多重比較分析，各實(shí)驗(yàn)組（A2、A3和A4）與對(duì)照組（A1-Control）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表1、2和圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Src激酶抑制劑PP2抑制Src激酶活化后，能顯著抑制QBC939細(xì)胞的體外侵襲能力，且5μmol/L的抑制效果較好。

2.3 PP2對(duì)QBC939細(xì)胞侵襲相關(guān)分子E-cadherin和CD44 m RNA水平的影響

圖1 PP2對(duì)QBC939細(xì)胞中p-Src蛋白表達(dá)的影響

表1 PP2對(duì)QBC939細(xì)胞侵襲能力的影響（觀測(cè)數(shù)據(jù)）

表2 PP2對(duì)QBC939細(xì)胞侵襲能力的影響（統(tǒng)計(jì)結(jié)果）

圖2 PP2對(duì)QBC939細(xì)胞侵襲能力的影響

經(jīng)Src激酶抑制劑PP2處理后，用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)QBC939細(xì)胞侵襲能力相關(guān)分子E-cadherin和CD44的在mRNA水平的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)PP2處理后，E-cadherin的mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3和4，圖3A）；而PP2組CD44的mRNA的表達(dá)則較對(duì)照組顯著減弱（表5和6，圖3B），經(jīng)分析差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，Src激酶抑制劑PP2抑制QBC939細(xì)胞中Src激酶的活化后，能上調(diào)腫瘤細(xì)胞侵襲抑制分子E-cadherin、下調(diào)腫瘤細(xì)胞促侵襲分子CD44的mRNA水平，而且5μmol/L的抑制濃度最佳。

2.4 PP2對(duì)QBC939細(xì)胞E-cadherin和CD44蛋白水平的影響

表3 PP2對(duì)E-cadherin mRNA表達(dá)的影響（觀測(cè)數(shù)據(jù)）

表4 PP2對(duì)E-cadherin m RNA表達(dá)的影響（統(tǒng)計(jì)結(jié)果）

經(jīng)Src激酶抑制劑PP2處理后，用Western Blot技術(shù)檢測(cè)了QBC939細(xì)胞侵襲能力相關(guān)分子E-cadherin和CD44的蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，PP2組E-cadherin的蛋白表達(dá)水平比對(duì)照組明顯增高；而與對(duì)照組相比，而PP2組CD44的蛋白表達(dá)水平則明顯降低。結(jié)果表明，Src激酶抑制劑PP2抑制QBC939細(xì)胞中Src激酶的活化后，能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲抑制分子E-cadherin的表達(dá)，減弱腫瘤細(xì)胞促侵襲分子CD44的表達(dá)。見圖4。

表5 PP2對(duì)CD44 m RNA表達(dá)的影響（觀測(cè)數(shù)據(jù)）

表6 PP2對(duì)CD44 m RNA表達(dá)的影響（統(tǒng)計(jì)結(jié)果）

圖3 PP2對(duì)QBC939細(xì)胞侵襲能力相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響

圖4 PP2對(duì)QBC939細(xì)胞侵襲能力相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響

3 討論

腫瘤的侵襲是一個(gè)復(fù)雜而繁瑣的過程，隨著細(xì)胞黏附性的降低，腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位，散落至其他部位，形成轉(zhuǎn)移灶[11]。Src激酶在肺癌、宮頸癌等多種實(shí)體惡性腫瘤組織中過表達(dá)和被活化，活化后的Src激酶磷酸化其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，通過復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程最終影響腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[12]。PP2是1995年被發(fā)現(xiàn)的一種pyrazolopyrimidine復(fù)合物，可選擇性抑制Src激酶家族，為Src激酶特異性抑制劑[13]。本研究通過PP2抑制人膽管癌QBC939細(xì)胞中Src激酶，觀察Src激酶抑制劑PP2對(duì)人膽管癌QBC939細(xì)胞侵襲能力的作用和機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，人膽管癌QBC939細(xì)胞中Src激酶處于高活性狀態(tài)，而用5μmol/L的Src激酶抑制劑PP2可顯著抑制QBC939細(xì)胞中p-Src的表達(dá)，即Src激酶的活性被Src激酶抑制劑PP2抑制了，本結(jié)果與已有研究的報(bào)道基本一致[14]。隨后，通過體外侵襲實(shí)驗(yàn)筆者發(fā)現(xiàn)，Src激酶抑制劑PP2抑制QBC939細(xì)胞Src激酶的活化后，QBC939細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱。但是Src激酶抑制劑PP2抑制Src激酶的活化后具體通過影響了QBC939細(xì)胞中什么因素致使該腫瘤細(xì)胞的侵襲能力減弱目前并不清楚。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，E-cadherin是廣泛存在于組織的上皮細(xì)胞中的蛋白分子，對(duì)細(xì)胞的黏附聚集十分重要[15]。該E-cadherin分子為腫瘤侵襲抑制分子，下調(diào)其表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)[16]。CD44分子則是與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)的腫瘤促侵襲分子，上調(diào)CD44的表達(dá)后，可使腫瘤細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，更易進(jìn)入血液和淋巴循環(huán)，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移灶的產(chǎn)生[17]。本研究結(jié)果顯示，Src激酶抑制劑PP2抑制Src激酶的活化后，E-cadherin分子mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)顯著增高，而CD44分子mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)則明顯降低。

上述結(jié)果提示，Src激酶抑制劑PP2抑制Src激酶的活化后，可能是通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞侵襲抑制分子E-cadherin、下調(diào)腫瘤細(xì)胞促侵襲分子CD44 mRNA的水平，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲抑制分子E-cadherin、減弱腫瘤細(xì)胞促侵襲分子CD44的表達(dá)，最終導(dǎo)致QBC939細(xì)胞侵襲能力的減弱。

綜上所述，本研究為膽管癌患者以Src激酶為治療靶標(biāo)的Src激酶特異性抑制劑抗腫瘤治療策略的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為Src激酶特異性抑制劑應(yīng)用于臨床奠定了理論基礎(chǔ)。

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