周 洛

（青海省玉樹(shù)藏族自治州囊謙縣畜牧獸醫(yī)工作站，囊謙815200）

犬細(xì)小病毒病（Canine parvovirus disease，CPVD）是由犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起犬科動(dòng)物的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，主要以高熱稽留、嘔吐、腹瀉、血便、脫水和白細(xì)胞顯著減少、出血性腸炎、心肌炎為主要臨床特征和病理變化[1.2]。犬細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科（Parvoviridae）細(xì)小病毒屬（Parvovirus），病毒對(duì)環(huán)境的耐受性很強(qiáng)，且傳播迅速，傳染性強(qiáng)，發(fā)病率達(dá)90%以上，病死率為10%～50%[3.4]。該病毒于1977年由美國(guó)學(xué)者從患出血性腸炎的犬糞便樣品中首次分離獲得，隨后呈全球性流行，是目前危害犬類(lèi)的主要傳染病之一，每年都給全球養(yǎng)犬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)梁士哲等[5]于1982年首次報(bào)道了類(lèi)似犬細(xì)小病毒感染所致的犬出血性腸炎，1983年徐漢坤等[6]正式報(bào)道了犬細(xì)小病毒流行情況。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代養(yǎng)犬密度的提高以及犬流動(dòng)性的增強(qiáng)，犬細(xì)小病毒感染有日益升高的趨勢(shì)[7.8]，全國(guó)各地均加強(qiáng)了針對(duì)犬細(xì)小病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查[3.9.10]。為更有效地控制該病的發(fā)生與流行，加強(qiáng)該病預(yù)防與治療藥物的研制迫在眉睫，本研究制備犬細(xì)小病毒組織滅活疫苗，并用其多次免疫高產(chǎn)蛋雞獲得高免卵黃抗體，通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該卵黃抗體具有良好的預(yù)防治療效果，可應(yīng)用于臨床，將為犬細(xì)小病毒病的綜合防治提供了一種簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、安全、有效的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1毒株來(lái)源 經(jīng)膠體金試紙條確診為犬細(xì)小病毒感染的強(qiáng)陽(yáng)性組織病料由西寧市某寵物醫(yī)院提供。

1.2病毒的增殖與提取 將犬細(xì)小病毒感染的強(qiáng)陽(yáng)性組織病料與3倍體積滅菌生理鹽水充分混合、搗碎、碾磨后肌肉注射1月齡健康犬2只，受病毒攻擊犬表現(xiàn)出體溫升高、精神沉郁、食欲廢絕、嘔吐、腹瀉、血便、血便帶有腥臭味、脫水、休克直至昏迷死亡等腸炎型犬細(xì)小病毒典型的癥狀特征。無(wú)菌取病死犬的腸道及內(nèi)容物與5倍體積滅菌生理鹽水充分混合、搗碎、碾磨、反復(fù)凍融、4層紗布過(guò)濾后，即得含犬細(xì)小病毒的病毒液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3組織滅活疫苗的制備 取-20℃保存的病毒液500mL，加甲醛1.0mL，置37℃溫箱中滅活24h，期間每隔4h搖晃1次。取滅活后的病毒液吐溫-80溶液20mL，組織搗碎機(jī)高速攪拌勻漿，即得水相。取96mL白油和4mL司本充分混合后加入4mL硬脂酸鋁，高壓滅菌，即得油相。以油相與水相3:1的比例進(jìn)行乳化，配置油包水型組織滅活疫苗，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4蛋雞的免疫 取40周齡健康產(chǎn)蛋雞30只，產(chǎn)蛋率在85%，以制備的組織滅活疫苗進(jìn)行免疫，首次免疫肌肉注射0.5mL/只，14d后進(jìn)行第二次免疫，二免肌肉注射1.0mL/只，14d后進(jìn)行第三次免疫，三免肌肉注射1.0mL/只，第三次免疫14d后收集雞蛋。

1.5卵黃抗體的提取將收集的雞蛋用水沖洗干凈后，依次使用碘酒和75%酒精擦拭消毒后，超凈工作臺(tái)中無(wú)菌分離卵黃，與等體積滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS）搗碎勻漿后，參照王建梅等[11]的鹽析法分離純化卵黃抗體。

1.6抗體效價(jià)測(cè)定 采集并制備1%豬紅細(xì)胞，按常規(guī)的血凝抑制試驗(yàn)（HI）方法測(cè)定卵黃抗體的抗體效價(jià)。

1.7安全性試驗(yàn) 取健康犬10只，將制備的高免卵黃抗體分別經(jīng)口服和肌肉注射健康犬各5只，2.0mL/只，觀察記錄試驗(yàn)犬的食欲、精神狀態(tài)、異常反應(yīng)等，觀察至14d。

1.8保護(hù)效果試驗(yàn) 將20只1月齡健康犬隨機(jī)分成4組（I組、II組、III組、IV組），每組5只，各組犬均肌肉注射1.2中制備的病毒液1.0mL，48h后I、II、III組每日分別口服制備的卵黃抗體0.3、0.5、1.0mL，連續(xù)服用2d，IV組為對(duì)照組。隔離飼養(yǎng)觀察至14d，掌握分析卵黃抗體不同使用劑量對(duì)患病犬的治療效果。

2 結(jié)果與分析

2.1卵黃抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果 采用HI試驗(yàn)方法測(cè)定卵黃抗體的抗體效價(jià)達(dá)1:512。

2.2安全性試驗(yàn)結(jié)果 10只試驗(yàn)犬食欲、精神狀態(tài)均良好，無(wú)任何異常反應(yīng)。

2.3保護(hù)效果試驗(yàn)結(jié)果 如表1所示，對(duì)照組的5只犬中4只死亡，死亡率高達(dá)80%，而卵黃抗體0.3、0.5、1.0mL使用劑量組的5只犬分別死亡3、1、0只，保護(hù)率分別達(dá)40%、80%和100%。表明當(dāng)卵黃抗體的使用劑量大于0.5mL時(shí)，對(duì)犬細(xì)小病毒的感染即可產(chǎn)生有效的保護(hù)作用。用犬細(xì)小病毒作為免疫抗原制備的犬細(xì)小病毒高免卵黃抗體，通過(guò)被動(dòng)免疫可使犬獲得堅(jiān)實(shí)的保護(hù)力，將成為特異性地預(yù)防和治療犬細(xì)小病毒病的良好生物制品。而在卵黃抗體母體來(lái)源的選擇上，蛋雞易于飼養(yǎng)，產(chǎn)蛋量高，一直是大批量生產(chǎn)卵黃抗體的首選試驗(yàn)動(dòng)物，且應(yīng)用異源動(dòng)物制備卵黃抗體，降低了同源疫病傳染的危險(xiǎn)。卵黃抗體的提取方法是能否獲得高效價(jià)抗體的關(guān)鍵，王建梅等[11]通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)酸化法、水稀釋法提取卵黃抗體對(duì)pH值和操作方法要求比較嚴(yán)格，在試驗(yàn)過(guò)程中較難掌握，將直接影響提取卵黃抗體的效價(jià)，而鹽析法受到外界環(huán)境因素的影響較小，提取過(guò)程簡(jiǎn)單、快速，制備的抗體效價(jià)亦較高。故本研究采用蛋雞作為抗體來(lái)源的試驗(yàn)動(dòng)物，采用鹽析法提取卵黃抗體，制備出的雞源犬細(xì)小病毒卵黃抗體的抗體效價(jià)達(dá)1:512，1.0mL使用劑量對(duì)人工感染犬細(xì)小病毒的治愈率達(dá)100%，具有較好的治療效果，為犬細(xì)小病毒病的綜合防治提供了一種簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、安全、有效的技術(shù)方法，同時(shí)也為其它動(dòng)物疫病的異源高免卵黃抗體的制備與應(yīng)用提供了有益的經(jīng)驗(yàn)。

表1 不同劑量卵黃抗體對(duì)犬感染CPV的治療效果

3 討論

隨著全球養(yǎng)犬業(yè)和寵物行業(yè)的快速發(fā)展，我國(guó)養(yǎng)犬?dāng)?shù)量不斷增加，犬細(xì)小病毒感染已嚴(yán)重阻礙我國(guó)養(yǎng)犬事業(yè)的穩(wěn)定與健康發(fā)展，目前犬細(xì)小病毒病尚無(wú)十分有效的治療方法和藥物，我國(guó)對(duì)其實(shí)行以疫苗免疫為主的綜合防控措施，但由于寵物犬分散、受犬母源抗體干擾、疫苗運(yùn)輸保存不善、免疫程序不合理以及個(gè)體差異等常導(dǎo)致免疫失敗，疫苗免疫效果不確實(shí)。研究探討治療制品一直是臨床領(lǐng)域的關(guān)鍵課題，用單克隆抗體制劑、犬細(xì)小病毒高免血清或犬細(xì)小病毒感染后康復(fù)犬血清對(duì)患病犬進(jìn)行被動(dòng)免疫效果雖好，但由于效價(jià)不穩(wěn)定、且血清采集難度較大，制造過(guò)程繁雜，產(chǎn)量低，成本高、不能滿(mǎn)足大量生產(chǎn)的需要。卵黃抗體化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有一定的耐酸、耐堿、耐熱性能，且具有制造簡(jiǎn)單、成本低、產(chǎn)量高、安全高效等特點(diǎn)，在其它動(dòng)物傳染病的綜合防控中已取得了良好的臨床應(yīng)用效果。采

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