弓青霞，宋 揚(yáng)，劉 佳，王麗穎，金作林

（陜西西安：1．軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，710032；2．解放軍第323醫(yī)院口腔科，710001）

應(yīng)用Label－free技術(shù)研究人牙囊細(xì)胞和牙周膜成纖維細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)

弓青霞1，宋 揚(yáng)2，劉 佳1，王麗穎1，金作林1

（陜西西安：1．軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，710032；2．解放軍第323醫(yī)院口腔科，710001）

目的：應(yīng)用Label－free蛋白定量技術(shù)研究牙囊細(xì)胞（hDFCs）和牙周膜成纖維細(xì)胞（hPDLFs）差異表達(dá)蛋白質(zhì)，為發(fā)現(xiàn)hDFCs向hPDLFs轉(zhuǎn)化過程中的重要蛋白質(zhì)提供參考。方法：應(yīng)用Label－free蛋白定量技術(shù)，結(jié)合ultramate 3000 nano－UPLC軟件，對(duì)hDFCs和hPDLFs總蛋白提取液進(jìn)行蛋白定性定量檢測。然后分別對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果行重復(fù)性、關(guān)聯(lián)性、蛋白相對(duì)含量和差異表達(dá)蛋白等進(jìn)行分析；對(duì)總體蛋白質(zhì)和差異表達(dá)蛋白質(zhì)行生物信息學(xué)GO或KEGG分析。結(jié)果：hDFCs和hPDLFs蛋白相對(duì)含量及總體蛋白GO分析結(jié)果相似。定量分析顯示，當(dāng)hDFCs分化形成hPDLFs后，有22個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中下調(diào)蛋白15個(gè)（P＜0．05，F(xiàn)C＞2），上調(diào)蛋白7個(gè)（P＜0．05，F(xiàn)C＞2）。結(jié)論：hDFCs和hPDLFs蛋白質(zhì)表達(dá)譜相似；22個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)為研究hDFCs向hPDLFs的轉(zhuǎn)化機(jī)制提供了方向。

牙囊細(xì)胞（hDFCs）；牙周膜成纖維細(xì)胞（hPDLFs）；Label－free定量蛋白組學(xué)

［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：270］

從發(fā)育的角度講，鐘狀期牙胚的牙乳頭細(xì)胞遷移至牙囊，并成為最早的牙囊細(xì)胞（human dental follicle cells，hDFCs）［1］，而后者將成為形成牙周組織的始祖細(xì)胞。牙周膜成纖維細(xì)胞（human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs）作為hDFCs終末分化細(xì)胞之一，其轉(zhuǎn)化過程中涉及復(fù)雜的基因、蛋白質(zhì)表達(dá)變化及相應(yīng)細(xì)胞的代謝改變。例如：BMP3是成骨分化和骨形成的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，在hDFCs向牙周組織發(fā)育后期的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，通過拮抗BMP2／BMP7的成骨分化和骨形成作用，以維持牙周膜內(nèi)非礦化狀態(tài)［2］，這與Lee等［3］報(bào)道的牙周膜中BMP3的表達(dá)水平高于牙囊相一致；牙周膜形成初期，牙囊中的間充質(zhì)細(xì)胞獲得極性，增殖分泌功能增加，形成最早的膠原纖維和糖蛋白基質(zhì)［4］，其他纖維成分如耐酸纖維的早期形成也與hDFCs相關(guān)［5］，而牙根發(fā)育完成后，hPDLFs則成為繼hDFCs后實(shí)現(xiàn)膠原降解、合成和牙周膜更新改建的主要?jiǎng)恿?xì)胞［6－8］。以上研究雖使我們對(duì)hDFCs－h(huán)PDLFs轉(zhuǎn)化過程中的單個(gè)基因、蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子的表達(dá)差異或細(xì)胞生命活動(dòng)有了一定的認(rèn)識(shí)，但關(guān)于總體蛋白水平差異的報(bào)道極少。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為我們對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的定性、定量研究提供了方法。其中蛋白定量分析可用以篩選和尋找任何因素引起的不同樣本間蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，并能對(duì)某些關(guān)鍵蛋白質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析，從而可用于分析干細(xì)胞不同分化階段的蛋白質(zhì)組差別。鑒于hDFCs和hPDLFs在生長發(fā)育上有一定的延續(xù)性，細(xì)胞分化處于不同階段，本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用Label－free蛋白定量技術(shù)研究hDFCs和hPDLFs在分化前后的重要差異蛋白質(zhì)，以期為研究hDFCs向hPDLFs的轉(zhuǎn)化機(jī)制提供線索。

1 材料和方法

1．1 主要試劑和儀器

α－MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco，美國）；I型膠原酶、2．5 g／L胰蛋白酶（Sigma，美國）；細(xì)胞總蛋白裂解液、BCA試劑盒（武漢博士德）；羊抗兔IgG／FITC、兔抗人波形蛋白、兔抗人角蛋白（北京博奧森）；SDS－PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天）；考馬斯亮藍(lán)R250（西安國安生物科技）；CO2孵箱（Forma，美國）；LTQ orbitrapVelos液質(zhì)聯(lián)用儀（Thermo，美國）戴安ultramate 3000 nano－UPLC分析軟件（Xcalibur，2．2 SP1）；垂直板電泳槽（Bio－rad，美國）；熒光顯微鏡（奧林巴斯，日本）；凝膠成像儀（Bio－Best，美國）。

1．2 方法

1．2．1 hDFCs、hPDLFs的分離培養(yǎng)

選取12～16歲志愿者因正畸減數(shù)而新鮮拔除的前磨牙10個(gè)（均無牙體、牙周疾?。⒓从肞BS沖洗并刮除其冠1／3和根尖1／3的牙齦或牙周膜后，分別置于I型膠原酶中37℃條件下全牙消化3 h。同時(shí)選取來自不同患者（均知情同意）、X線顯示第三磨牙阻生且為牙胚狀態(tài)的牙囊10個(gè)，將牙囊組織從牙冠表面小心分離后，立即用PBS沖洗，并將其修剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，然后置于I型膠原酶中37℃消化30min。牙囊和離體牙均按照收集順序隨機(jī)分配到hPDLFs1、hPDLFs2組或hDFCs1、hDFCs2組，以便于質(zhì)譜分析。

上述消化結(jié)束后，分別收集兩種組織的消化液，并離心棄上清；將各組織的沉淀部分滴加適量α－MEM完全培養(yǎng)液后，分別接種于24孔板，置于37℃、50mL／L CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊邊緣爬出（7～8 d），并爬滿孔底80%時(shí)，胰酶消化傳代，取2～3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 hDFCs、hPDLFs的免疫熒光鑒定

取3代hDFCs、hPDLFs分別制備成單層細(xì)胞爬片后，40 g／L多聚甲醛固定15 min；PBS沖洗，PBS－Triton透膜20 min；復(fù)合消化酶消化3min，5 g／mL BSA室溫封閉30 min。然后分別在hDFCs、hPDLFs爬片上各滴加兔波形蛋白抗體（1∶100）、兔角蛋白抗體（1∶100）4℃過夜。18 h后，避光條件下滴加羊抗兔IgG／FITC（1∶200），37℃孵育20min；PBS沖洗，滴加DAPI（1∶200）室溫孵育7min；封片，熒光顯微鏡觀察。

1．2．3 hDFCs、hPDLFs總蛋白的SDS－PAGE電泳

提取hDFCs、hPDLFs總蛋白質(zhì)，分別測定其蛋白濃度；將6×Loadingbuffer與各蛋白質(zhì)提取液按1∶5混合并沸水浴5 min后置于冰上備用；配置120 g／L的SDS－PAGE膠體，連接垂直板電泳槽；兩種細(xì)胞蛋白分別取20、35、50 g，加入梳孔，并同時(shí)上樣5μL蛋白Marker（10～170KD）進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳（壓縮膠60 V、30 min，分離膠100 V、150min）。電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍(lán)染色過夜，洗脫液漂洗膠體后凝膠成像儀照相。

1．2．4 hDFCs、hPDLFs總蛋白質(zhì)色譜質(zhì)譜檢測及定性定量分析

分別取hDFCs1、hDFCs2、hPDLFs1、hPDLFs2 4種蛋白樣品，經(jīng)預(yù)處理后用LTQ orbitrap Velos液質(zhì)聯(lián)用儀及戴安ultramate 3000 nano－UPLC軟件進(jìn)行分析。上機(jī)量分別為10μL，首先進(jìn)入保護(hù)柱（C18 PepMap100，300μm×1mm，5μm，100?），隨后進(jìn)入分析柱（Acclaim PepMap C18，15 cm×75μm，2μm，100?，Dionex），并以流速0．2μL／min進(jìn)行分析；流動(dòng)相B梯度為5%～45%，相應(yīng)的流動(dòng)相A梯度是95%～55%（流動(dòng)相B：乙腈、1．23 g／L甲酸；流動(dòng)相A：超純水、1．23 g／L甲酸），檢測時(shí)間為125 min。質(zhì)譜參數(shù)：陽離子模式，CID碰撞模式，120 000分辨率，質(zhì)量范圍350～1 800，NCE為35%，top16離子強(qiáng)度用于串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS／MS）分析。

Orbitrap原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用maxquant（1．5．0．12）和Andromeda軟件，并參考IPI人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)V3．87對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性。定性檢索方法為：酶切類型為胰蛋白酶全酶切，母離子質(zhì)量誤差為±10 ppm，固定修飾為Carbamidomethylation（半胱氨酸），可變修飾為G1cNAc（天冬酰胺），Carbamidomethylation（賴氨酸，肽段N端）和Oxidation（蛋氨酸），IPI一個(gè)蛋白匹配的多肽最少長7個(gè)氨基酸，肽段和蛋白FDR＜0．01，最少匹配unique peptide數(shù)目為1。同時(shí)以LFQ和iBAQ兩參數(shù)進(jìn)行蛋白定量，其中LFQ的對(duì)數(shù)（log2）用于后續(xù)蛋白定量分析。

1．2．5 hDFCs和hPDLFs蛋白組分析方案

首先用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算相同來源樣本的生物學(xué)重復(fù)性及定量數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)性。

然后采用DAVID（http：／／david．a(chǎn)bcc．ncifcrf．gov／）和WEGO（http：／／wego．genomics．org．cn／cgib－in／wegoindex．pl）對(duì)hDFCs和hPDLFs的總體蛋白質(zhì)進(jìn)行GO分類分析。

用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算hDFCs和hPDLFs中相同蛋白質(zhì)LFQ值對(duì)數(shù)（log2）的比值，用以考察蛋白比例的分布；同時(shí)對(duì)相同蛋白LFQ值的對(duì)數(shù)（log2）進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析蛋白表達(dá)量的差異，并以P＜0．05和倍性變化FC＞2作為最終差異蛋白。

采用DAVID和WEGO對(duì)所有蛋白和差異蛋白進(jìn)行GO分類分析，研究差異蛋白和所有蛋白GO term的異同。采用DAVID對(duì)所有差異蛋白進(jìn)行KEGG Path－way分析。

2 結(jié)果

2．1 hDFCs和hPDLFs的鑒定結(jié)果

免疫熒光檢測顯示，間充質(zhì)來源的hDFCs和hPDLFs均陽性表達(dá)波形絲蛋白，陰性表達(dá)角蛋白（圖1）。

圖1 hDFCs和hPDLFs細(xì)胞角蛋白和波形絲蛋白的表達(dá)（×10）

2．2 SDS－PAGE電泳結(jié)果

hDFCs和hPDLFs的細(xì)胞總蛋白質(zhì)分布均勻，均無極高豐度的蛋白質(zhì)，符合色譜質(zhì)譜檢測對(duì)蛋白豐度的要求；等上樣量時(shí)在10～170 KD二者具有相似的蛋白條帶（圖2）。

2．3 hDFCs和hPDLFs的蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定

在樣本hPDLFs1的二級(jí)質(zhì)譜（MS／MS）中鑒定出2 305個(gè)肽段，其中可識(shí)別的唯一肽段有1 613個(gè)，這些唯一肽段在IPI人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中可以匹配到565種蛋白質(zhì)上，其他樣本質(zhì)譜結(jié)果見表1。4樣本共鑒定出907個(gè)蛋白組。

表1 hDFCs1、hDFCs2、hPDLFs1、hPDLFs2的質(zhì)譜鑒定

圖2 hDFCs和hPDLFs的SDS－PAGE電泳

2．4 hDFCs1和hDFCs2、hPDLFs1和hPDLFs2的生物學(xué)重復(fù)性及數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)性分析

hDFCs1和hDFCs2共有68．1%和73．3%的蛋白數(shù)量一致，樣本間蛋白定量的關(guān)聯(lián)性為r＝0．73；hPDLFs1和hPDLFs2共有84．3%和65．3%蛋白數(shù)量一致，關(guān)聯(lián)性r＝0．87（圖3）。提示，樣本的生物學(xué)重復(fù)檢測良好，同種樣本間一致程度較高。

圖3 生物學(xué)重復(fù)性（左）和數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)性（右）

2．5 hDFCs和hPDLFs中相同蛋白比例的分布情況

SDS－PAGE顯示，兩細(xì)胞間相同分子量區(qū)域內(nèi)蛋白質(zhì)的豐度極其相似，故對(duì)兩細(xì)胞同一種蛋白質(zhì)的定量數(shù)據(jù)（LFQ值）的比值進(jìn)行柱狀圖分析；從圖中可以看出，其蛋白的比例呈正態(tài)分布，大多數(shù)蛋白的比例均位于1［log2（hPDLCs／hDFCs）＝0］附近（圖4）。

圖4 相同蛋白比值分布

2．6 hDFCs和hPDLFs總體蛋白的GO分析

GO分析顯示，兩種細(xì)胞的總蛋白質(zhì)在大多數(shù)GO分類項(xiàng)目（細(xì)胞成分、分子功能、生物過程及其子分類）下非常相似，只有在生物過程下的rhythmic process（節(jié)律性過程）中hDFCs較hPDLFs有更多相關(guān)蛋白表達(dá)（圖5）。

2．7 差異蛋白分析

對(duì)hDFCs和hPDLFs中相同蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析后顯示，22個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，F(xiàn)C＞2），其中下調(diào)蛋白質(zhì)15個(gè)（AKR1A1、ALCAM、CDC42、CTGF、CYR61、DDX1、DDX17；DDX5、DDX39A、F2、FKBP4、FST、GDI1；GDI2、MAT2A、RPL18A、TOMM6），上調(diào)蛋白質(zhì)7個(gè)（DRAP1、ECI1、EIF3G、HSP90B1、NIT1、PPP1CB、STX7）（圖6）。

圖5 hDFCs和hPDLFs總體蛋白GO分析

2．8 差異蛋白和總體蛋白的GO分析

使用DAVID分析軟件將所有蛋白質(zhì)和差異蛋白質(zhì)向GO數(shù)據(jù)庫的各節(jié)點(diǎn)映射后，可見CTGF，CYR61（分化后均下調(diào)）在分子功能上富集于胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（圖7）。

2．9 差異蛋白質(zhì)KEGG分析

22個(gè)差異蛋白質(zhì)中只有3個(gè)對(duì)比到KEGG Pathway，分別為CDC42、F2、PPP1CB，參與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)通路（圖8）。

圖6 差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜

圖7 差異蛋白和總體蛋白的GO分析

圖8 差異蛋白質(zhì)CDC42、F2、PPP1CB的KEGG分析

3 討論

差異蛋白質(zhì)組學(xué)最初應(yīng)用于干細(xì)胞相關(guān)研究，可分析不同來源干細(xì)胞、干細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后蛋白質(zhì)表達(dá)的變化［9－11］。hPDLFs是hDFCs最重要的終末分化細(xì)胞之一，二者雖然在細(xì)胞形態(tài)、免疫熒光及總體蛋白表達(dá)譜上均有相似性，但卻處于分化不同階段，是兩種具有組織學(xué)延續(xù)性的不同細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)借助Label－free蛋白定量技術(shù)分析了hPDLFs和hDFCs在蛋白表達(dá)水平的相似性和差異性，并觀察了hDFCs成纖維分化前后細(xì)胞蛋白表達(dá)的改變。

為提高蛋白質(zhì)定性定量的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)選擇了Label－free蛋白定量技術(shù)，該方法區(qū)別于雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜法、穩(wěn)定同位素標(biāo)簽法，是后基因時(shí)代發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)微量變化中較為精確的方法［12］。同種來源細(xì)胞設(shè)計(jì)樣本重復(fù)，在蛋白質(zhì)生物學(xué)重復(fù)性和定量數(shù)據(jù)相關(guān)性檢驗(yàn)良好的前提下（圖3），進(jìn)行兩細(xì)胞總蛋白譜和差異蛋白質(zhì)分析。

hDFCs／hPDLFs各蛋白比例的柱狀圖分析顯示，絕大多數(shù)蛋白的比值分布于1附近，即hDFCs、hPDLFs雖然處于分化不同階段，但是兩種細(xì)胞在蛋白質(zhì)種類及含量上非常相似，多數(shù)蛋白質(zhì)含量無明顯差異。GO分析進(jìn)一步證實(shí)，兩種細(xì)胞總蛋白質(zhì)在細(xì)胞成分、分子功能、生物過程及其相應(yīng)term中多數(shù)無明顯差異。除去個(gè)別差異表達(dá)蛋白質(zhì)（圖6），以上結(jié)果提示hPDLFs與hDFCs總蛋白譜在蛋白種類、含量、功能上具有極大的相似性。

差異蛋白質(zhì)ALCAM、CTGF、CYR61在hPDLFs中下調(diào)表達(dá)，可能是hDFCs分化后干性降低的標(biāo)志。CTGF、CYR61在分子功能上屬于胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白，在胚胎發(fā)育期各種結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用。CYR61能促進(jìn)成骨、成軟骨分化，愈合中的骨痂較正常骨高表達(dá)［13］。咀嚼力刺激可誘導(dǎo)牙周膜內(nèi) CTGF上調(diào)［14］；CTGF可促進(jìn)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的增殖分化及骨基質(zhì)礦化［15］。CYR61和CTGF在胚胎發(fā)育早期多種間充質(zhì)來源的組織中有隨組織發(fā)育表達(dá)降低的趨勢［16］。ALCAM的表達(dá)蛋白質(zhì)是活化白細(xì)胞粘附因子CD166，作為干細(xì)胞標(biāo)志物在hDFCs和hPDLFs中都有表達(dá)［17－18］。由此推測ALCAM、CTGF、CYR61的下調(diào)表達(dá)，可能是hDFCs逐漸喪失胚胎期干性并最終分化形成hPDLFs的結(jié)果，但這需要對(duì)牙囊－牙周膜發(fā)育過程行進(jìn)一步免疫組化驗(yàn)證。

差異蛋白質(zhì)中CDC42、F2、PPP1CB可以對(duì)比到細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)通路。CDC42可以激活蛋白激酶（PAK）通路，從而調(diào)控細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)重塑。PPP1CB是蛋白磷酸酶1（PP1）的β催化亞基，后者參與數(shù)千種蛋白質(zhì)的去磷酸化，與細(xì)胞分裂密切相關(guān)。F2為凝血酶原，是凝血酶的前體，后者與蛋白酶激活受體結(jié)合后具有蛋白酶活性，可以刺激成纖維細(xì)胞聚集和收縮［19］。由于牙周膜發(fā)育過程中伴隨咬合力刺激，hDFCs在分化形成hPDLFs的同時(shí)，也由牙囊期的細(xì)胞無規(guī)則散在排列，逐漸獲得極性，演變?yōu)檠匮乐苣つz原纖維改建方向排列，建牙合不同時(shí)期成纖維細(xì)胞的長軸與牙根間的夾角不同［20］；此外在牙周膜發(fā)育完成后，機(jī)械力刺激可以進(jìn)一步誘導(dǎo)hPDLFs的細(xì)胞骨架沿機(jī)械力方向重排［21］。hPDLFs為適應(yīng)咀嚼力刺激自發(fā)進(jìn)行細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)的生物學(xué)行為區(qū)別于hDFCs，這可能是hDFCs和hPDLFs出現(xiàn)細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)差異的主要原因。

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The differential proteom ics of human dental follicle cells and human periodontal ligament fibroblasts analysed w ith Label－free technology

GONG Qing－xia*，SONG Yang，LIU Jia，WANG Li－ying，JIN Zuo－lin
（*State Key Laboratory Of Military Stomatology，Department of Orthodontics，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xi′an 710032，China）

AIM：To identify the differentially expressed proteins of human dental follicle cells（hDFCs）and human periodontal ligament fibroblasts（hPDLFs）with Label－free protein quantification technique．METHODS：Combined with ultramate 3000 nano－UPLC software，Label－free protein quantification was used to examine the total protein extraction samples from hDFCs and hPDLFs．For the proteins identified，the repeatability，the correlation，the relative content of proteins and the differentially expressed proteins of hDFCs and hPDLFs were analyzed．Bioinformatic analysis of GO and KEGG was applied for the analyses of total proteins of hDFCs and hPDLFs，aswell as the differentially expressed proteins．RESULTS：The relative content of proteins and the results of GO analysis of hDFCs swere similar to those of hPDLFs．22 differentially expressed proteinswere identified，ofwhich 15 were down－regulated，7 were up－regulated．CONCLUSION：Label－free quantitative proteomics confirmed the similar proteins profile between hDFCs and hPDLFs．22 differentially expressed proteins provide clues for the transformation mechanism from hDFCs to hPDLFs．

human dental follicle cells（hDFCs）；human periodontal ligament fibroblasts（hPDLFs）；Labelfree quantitative proteomics

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0270－07

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．003

2015－01－09；

：2015－03－24

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81271176）

弓青霞（1986－），女，漢族，河南人。碩士生（導(dǎo)師：金作林）

金作林，E－mail：zuolinj＠fmmu．edu．cn