張賽奇，王 米，雷 娜，楊銳樂， 薛飛群

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸藥安全評(píng)價(jià)與獸藥殘留研究重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200241)

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中藥對(duì)豬源大腸桿菌O8體外抑菌試驗(yàn)研究1*

張賽奇，王 米*，雷 娜，楊銳樂， 薛飛群*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸藥安全評(píng)價(jià)與獸藥殘留研究重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200241)

為了探討豬源大腸桿菌O8對(duì)黃連等10種中藥的體外敏感性，采用瓊脂擴(kuò)散法和微量二倍稀釋法對(duì)10種中藥水提物進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，測(cè)定抑菌圈直徑和最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果表明：黃連對(duì)大腸桿菌O8呈高度敏感，抑菌圈直徑為21.3 mm，其MIC值為7.813 mg/mL，抑菌效果最好；黃芩、五倍子呈中度敏感，其MIC值為31.25 mg/mL；而苦參不敏感，其MIC值為500 mg/mL，抑菌效果差。

中藥；豬源大腸桿菌O8； 體外抑菌試驗(yàn)；最小抑菌濃度

大腸桿菌是造成新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的最重要病原，其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌( ETEC) 是最主要的致病菌，病原以O(shè)8、O101等大腸桿菌較為常見，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害極大[1]。大腸桿菌的血清型比較多，引起的疾病目前無理想的疫苗來預(yù)防，臨床多采用抗菌藥物進(jìn)行治療，但由于抗菌藥物持續(xù)地和不恰當(dāng)?shù)厥褂茫瑢?dǎo)致大腸桿菌耐藥機(jī)制不斷變遷，耐藥性不斷提高，同時(shí)這些藥物大量使用造成畜產(chǎn)品中藥物殘留嚴(yán)重，從而威脅人類健康。如何選用對(duì)大腸桿菌有較好抑制作用的藥物是當(dāng)今獸醫(yī)臨床的主要任務(wù)之一。

中獸醫(yī)理論認(rèn)為，中藥具有提高機(jī)體免疫力、抗菌、中和降解毒素和促進(jìn)腸黏膜愈合等作用。同時(shí)，中藥主要通過調(diào)整機(jī)體功能狀態(tài)來實(shí)現(xiàn)抗菌作用，而西藥側(cè)重于藥物與微生物間的作用[2]。中藥的這種獨(dú)特優(yōu)勢(shì)為人們提供了新的研究?jī)?nèi)容。雖然目前市場(chǎng)上有很多純中藥獸藥產(chǎn)品，但對(duì)其基礎(chǔ)研究仍比較薄弱。近年來，有關(guān)中藥對(duì)病原菌的體外抑菌效果陸續(xù)有報(bào)道，但一般只對(duì)中藥的抑菌屬性進(jìn)行定性分析。本研究旨在對(duì)10種單味中藥對(duì)豬源大腸桿菌O8的體外抑菌活性進(jìn)行定性和定量研究，以便為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中藥黃柏、苦參、生大黃、連翹、白頭翁、五倍子、秦皮、金銀花、黃連、黃芩均購(gòu)于上海安德大藥房，所有藥物經(jīng)鑒定均符合生藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。豬源致病性大腸桿菌O8，型號(hào)C83901，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所微生物貯藏中心。培養(yǎng)基：①普通肉湯培養(yǎng)基: 牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，純化水至1 000 mL， pH 7.2～7.4; ②普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基: 蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，純化水至1 000 mL，pH 7.2～7.4。配制后高壓滅菌后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

主要儀器：R 系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司生產(chǎn);ESCO生物安全柜，新加坡Esco 科技有限公司生產(chǎn)；96微孔板，丹麥Nune 公司產(chǎn)品；微量移液器，德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；高速離心機(jī)，ThermoFisher Scientific公司生產(chǎn)。

1.2 菌液培養(yǎng)

試驗(yàn)前將菌種接種到肉湯培養(yǎng)基復(fù)活備用。將復(fù)活的供試菌接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，待菌種復(fù)壯后使用。挑取典型菌落接種于新鮮肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16～18 h， 連續(xù)培養(yǎng) 3代，以恢復(fù)其活力。用滅菌生理鹽水稀釋培養(yǎng)液，按照麥?zhǔn)媳葷岱ㄊ蛊錆岫冗_(dá)1×105～1×109CFU/mL，備用。

1.3 藥物制備

10味中藥分別加適量的水浸潤(rùn)后，加10倍量的水加熱煮沸，煮沸后改文火煮1 h，前后共煮兩次。合并兩次藥液，過濾，離心沉淀、最后濃縮至含量為1 mL相當(dāng)于原生藥1 g。分裝，調(diào)整pH至7.3，流通蒸氣滅菌20 min，4 ℃保存。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 瓊脂擴(kuò)散法 參考文獻(xiàn)[3]將之前培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌懸液稀釋成107cfu/mL，分別取1 mL于培養(yǎng)皿內(nèi)，再加入20 mL冷卻至45 ℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混勻，完全冷卻后用直徑6 mm的打孔器均勻打孔，每板4孔，去除孔內(nèi)瓊脂并適當(dāng)封閉孔底。每孔加入100 μL中藥提取液，以滿而不溢為宜并做好標(biāo)記。置4 ℃冰箱中作用1 h后取出，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量各抑菌圈直徑，判斷各種藥液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果。無菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)： 抑菌圈直徑>20 mm為高敏,抑菌圈直徑15～20 mm為中敏,抑菌圈直徑10～15 mm為低敏，抑菌圈直徑<10 mm為不敏感。

1.4.2 微量2倍稀釋法(MIC試驗(yàn)) 參考文獻(xiàn)[4]將各中藥提取液用2倍法配成系列濃度的供試藥液，分別加入96孔板的第2孔至第11孔，每孔100 μL，再將之前培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌懸液稀釋成107cfu/mL，每孔加入100 μL，至此96孔板每孔體積為200 μL(為避免培養(yǎng)過程中水分蒸發(fā)不均造成的影響，第1孔和第12孔不加藥，僅加入200 μL無菌水)，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，每孔再加入40 mL濃度為0.2 mg/μL的碘硝基四唑紫指示劑，繼續(xù)培養(yǎng)30 min后取出觀察每孔細(xì)菌生長(zhǎng)情況，其中渾濁并帶有粉色沉淀的說明有細(xì)菌生長(zhǎng)，澄清透明的則說明在該孔相應(yīng)的藥物濃度下對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝有抑制作用，最小抑菌濃度值(MIC值)即能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度。無菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試中藥敏感性測(cè)定結(jié)果

從表1知，各中藥對(duì)大腸桿菌的敏感性不同，其中黃連對(duì)豬源大腸桿菌O8的敏感性最強(qiáng)，其抑菌圈直徑為21.3 mm；黃芩、黃柏和五倍子為中度敏感，其抑菌圈直徑分別為17.0 mm、16.7 mm和17.3 mm；連翹、金銀花、大黃、白頭翁和秦皮對(duì)大腸桿菌具有較低的敏感性，抑菌圈直徑分別為10.3 mm、13.3 mm、14.7 mm、12.1 mm和14.6 mm；而苦參則對(duì)大腸桿菌沒有敏感性，沒有呈現(xiàn)明顯的抑菌圈。

表1 不同中藥的體外抑菌效果

注：抑菌圈直徑為3次平均值，抑菌圈大小包括孔徑(6 mm);“-”表示未檢出。

Notes: The inhibitory zone diameter was the average values of 3 tests, and the size of inhibitory zone included the bore diameter(6 mm) ；“-” means the inhibitory zone could not be obtained.

2.2 MIC的測(cè)定結(jié)果

從表2可以看出，各中藥對(duì)大腸桿菌均具有一定的抑菌效果，各中藥的MIC 值有一定的差異，其中黃連、黃芩和五倍子的抑菌效果較強(qiáng)，其MIC值分別為7.82、15.63和15.63 mg/mL，明顯高于其他中藥；其次為黃柏、大黃、金銀花、秦皮等，這些中藥對(duì)大腸桿菌的MIC值沒有超過125 mg/mL，也表現(xiàn)出較好的抑菌效果；依次為白頭翁、連翹，這兩味中藥也呈現(xiàn)出一定的抑菌效果；而苦參的抑菌效果較差，MIC值已超過250 mg/mL。

表2 各中藥最低抑菌濃度(MIC)試驗(yàn)結(jié)果

注：“-”表示無細(xì)菌生長(zhǎng)；“+”表示有細(xì)菌生長(zhǎng)，隨著“+”數(shù)增加菌落長(zhǎng)勢(shì)增強(qiáng)。

Notes:“-” means no bacterial growth;“+” means bacterial growth, and with the increase of “+” the colonies grow better.

3 討 論

研究中藥對(duì)病原菌的體外抑菌活性試驗(yàn)方法很多,一般采用的方法有管碟法、固體培養(yǎng)基法、紙片抑菌法、平皿稀釋法以及瓊脂擴(kuò)散法等，它們通常只用于對(duì)中藥的抑菌活性作定性研究，定量分析常用二倍稀釋法[5]。本試驗(yàn)中，筆者采用瓊脂擴(kuò)散法和二倍稀釋法兩種方法，同時(shí)對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行了稍加改進(jìn)。結(jié)果表明，這2種方法具有一定的相關(guān)性，同時(shí)也存在一定的差異性。

本次試驗(yàn)所取中藥分為清熱藥、解表藥、攻下藥和收澀藥等[6]。10種中草藥體外抑菌試驗(yàn)表明，在中藥濃度為1 g/mL時(shí)，黃連對(duì)豬大腸桿菌呈高度敏感，最小抑菌濃度為7.82 mg/mL，表現(xiàn)出很好的抑菌效果，這與李福娟[7]報(bào)道的相一致；其次為黃柏、大黃、金銀花等，其對(duì)豬大腸桿菌呈中度敏感，最小抑菌濃度沒有超過125 mg/mL，也表現(xiàn)出一定的抑菌效果，不過岳云升等[8]發(fā)現(xiàn)大黃對(duì)大腸桿菌幾乎無抑制作用；苦參對(duì)豬大腸桿菌不敏感，其最小抑菌濃度也已超過250 mg/mL。本試驗(yàn)結(jié)果與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)存在一定的差異，主要原因可能是之前的研究與本研究相比，所用大腸桿菌來源不同，其致病力不同，本研究所用的菌種為豬源致病性大腸桿菌。

總之，本試驗(yàn)研究表明，除苦參外，9種中藥對(duì)豬源大腸桿菌O8都有不同程度的抑制作用，該研究結(jié)果對(duì)臨床應(yīng)用中藥防治豬大腸桿菌病具有一定的指導(dǎo)意義；而根據(jù)中藥的體外抑菌效果及中獸醫(yī)理論組方，篩選效果良好的抗菌中藥復(fù)方需要進(jìn)一步的研究。

[1] 張鵬飛．中西醫(yī)結(jié)合治療仔豬黃白痢病[J]．畜牧獸醫(yī)雜志，2008，27(6)：111-113．

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[5] 陳 莉，朱鳳靜，張春枝． 30種中藥水提取物的體外抗菌活性試驗(yàn)[J].大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005,24(4)：269-271．

[6] 唐志書，李 敏．中藥學(xué)筆記圖解[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009．

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Antibacterial Sensitivity of Chinese Herbal Medicine against SwineEscherichiacoliO8in Vitro

ZHANG Sai-qi, WANG Mi*,LEI Na, YANG Rui-le, XUE Fei-qun

(KeyLaboratoryofAnimalParasitologyofMinistryofAgriculture,KeyOpenLaboratoryofVeterinaryDrugSafetyEvaluationandResiduesResearchofChineseAcademyofAgriculturalSciences,ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,Shanghai200241,China)

Inhibitory effect of 10 kinds of Chinese herbal medicine was explored for swine Escherichia coli O8(E.coli)in vitro by using the agar plate diffusion method and trace double dilution method. The diameter of the inhibitory zone and minimum inhibitory concentration (MIC) was determined. The results showed thatCoptischinensiswas highly sensitive to swineE.coli,the inhibitory zone diameter was 21.3 mm,and its MIC forE.coliO8was 7.813 mg/mL, indicating best inhibitory effect;Scutellariabaicalensis,GallaChinensiswere moderately sensitive with a MIC of 31.25 mg/mL; However,Sophoraflavessentiswas insensitive with MIC to be 500mg/ml, displaying a poor inhibitory effect.

Chinese herbal medicine; swineEscherichiacoliO8; bacteriostatic test in vitro ; minimum inhibitory concentration

2015-02-02

2015-04-02

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303040-08)；863計(jì)劃課題(2011AA2114)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31272607)

張賽奇(1990-) ，男，河南漯河人，碩士，研究方向?yàn)橹蝎F藥。E-mail：zhangsaiqi0104@163.com

*[通訊作者] 王 米(1975-)，男，四川綿陽人，博士，研究方向：中獸醫(yī)與中西獸醫(yī)結(jié)合。E-mail:wangmi@shvri.ac.cn; 薛飛群(1956-) ，男，甘肅天水人，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾芦F藥研究與開發(fā)。E-mail:feiqun@ gmail.com

S811.6

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1005-5228(2015)08-0062-04