王毅鵬 彭葆坤 朱麗芹 翁曉春 王瑛 唐哲

自身免疫性甲狀腺疾病（autoimmune thyroid disease，AITD），包括彌漫性毒性甲狀腺腫（Graves disease，GD）和橋本氏甲狀腺炎（Hashimoto's thyroiditis，HT），是器官特異性自身免疫性疾病。其發(fā)病為多基因遺傳與復(fù)雜的環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[1]。近年來有多項研究顯示細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4 （Cytotoxic T lymphocyteassociated Antigen 4，CTLA-4）在GD遺傳易感性中占有重要的地位[2-5]。CTLA-4又名CD152分子，是一種T細(xì)胞上的跨膜受體，在T細(xì)胞表面重要的協(xié)同刺激分子受體。免疫反應(yīng)中T細(xì)胞活化有兩類信號是必需的，第一類是抗原肽-HLA復(fù)合物，由抗原呈遞細(xì)胞所呈遞和特殊的T細(xì)胞受體識別，然后將信號傳遞給T細(xì)胞。第二類就是協(xié)同刺激信號，由抗原呈遞細(xì)胞上的協(xié)調(diào)刺激分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)的受體結(jié)合而產(chǎn)生。如果缺乏此類信號，T細(xì)胞會出現(xiàn)活化障礙，處于無反應(yīng)狀態(tài)甚至被誘導(dǎo)凋亡；反之若此類刺激過度則可能激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞，導(dǎo)致自身免疫疾病的發(fā)生。B7：CD28/CTLA-4為此過程中最重要的協(xié)同刺激途徑。CTLA-4與CD28共同享有B7分子配體，其中CD28識別B7-1和B7-2后為T細(xì)胞提供正性的共刺激信號，而CTLA-4與B7結(jié)合后則對T細(xì)胞活化起負(fù)調(diào)節(jié)作用[6]。

關(guān)于CTLA-4基因多態(tài)性與AITD的相關(guān)性，國內(nèi)外各家報道不盡相同，為此，筆者對GD、HT患者的CTLA-4基因第1外顯子第17密碼子49位點A/G多態(tài)性進(jìn)行研究，以深入探討關(guān)于CTLA-4與AITD的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院內(nèi)分泌科就診并確診的GD及HT患者，其中有82例GD患者為GD組，男24例，女58例，平均年齡（28.4±7.0）歲；51例HT患者為HT組，男11例，女40例，平均年齡（28.7±4.3）歲。根據(jù)臨床表現(xiàn)、體格檢查、輔助檢查（甲狀腺功能測定和甲狀腺超聲）診斷。選取健康對照組80例，男30例，女50例，平均年齡（30.5±8.1）歲，均來自本院體檢中心，均無甲狀腺疾病及其他自身免疫病的家族史。三組在年齡、性別、飲酒和吸煙等方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。所有研究對象均為云南地區(qū)的漢族。

1.2 CTLA-4基因多態(tài)性測定

1.2.1 標(biāo)本采集 使用乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）抗凝管，取受檢者空腹（禁食12 h后）靜脈血2 mL，-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 DNA的提取 用AxyPrep血基因組DNA試劑盒從收集的血標(biāo)本中提取基因組DNA，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 目的片段聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）由 上 海 生 物 工 程 有 限公司合成引物，引物序列為：上游引物：5'-GCTCTACTTCCTGAAGACCT-3'， 下 游 引 物：5'-AGTCTCACTCACCTTTGCAG_3'，擴(kuò)增片段長度為162 bp。PCR反應(yīng)體系：將保存的基因組DNA原液用DNA溶解液稀釋至5~10 ng/L。PCR反應(yīng)體系為15 μL，10×Taq buffer擴(kuò)增緩沖液1.5 μL；4種dNTP混合物0.3 μL（2.5 mM each）；上下游引物各 0.2 μL；模板 DNA 0.5 μL；Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL；MgCl2為1.2 μL；加雙蒸水11 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min， 然后按照 95 ℃變性 30 s， 67.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸 60 s，循環(huán) 20次；95 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)20次；最后72 ℃延伸 6 min。

1.2.4 限制性內(nèi)切酶法檢測CTLA-4基因多態(tài)性 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Bbv1在37 ℃恒溫箱中消化24 h，之后用3%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切片段，若出現(xiàn)162 bp一條條帶，判定為AA純合基因型；若出現(xiàn)162、88 bp和74 bp三條條帶，判定為AG雜合基因型；若出現(xiàn)88、74 bp兩條條帶，判定為GG純合基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗檢驗各組基因頻率、等位基因的分布；數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行，計量資料符合正態(tài)分布，以（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料的比較采用 X2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTLA-4基因第1外顯子第17密碼子49位點基因型及等位基因分布頻率比較 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡法檢驗各組基因頻率表明，實際值與根據(jù)Hardy-Weinberg定律計算而得的理論值間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ X2=0.13，P=0.72； X2=1.68，P=0.19； X2=2.11，P=0.15）。此3種基因型頻率均符合Hardy-Weinberg定律，等位基因的分布具群體代表性。

2.2 各組基因型及基因型分布頻率 GD組GG基因型的頻率及等位基因G的頻率明顯高于健康對照組（ X2=9.353，P=0.009； X2=7.548，P=0.006），見表 1。而HT組GG基因型的頻率及等位基因G的頻率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ X2=0.062，P=0.969； X2=0.046，P=0.830），見表 2。

表1 GD組和對照組基因型及等位基因分布頻率 頻次（%）

表2 HT組和對照組基因型及等位基因分布頻率 頻次（%）

3 討論

CTLA-4基因定位于2q31-33，包括有4個外顯子和3個內(nèi)含子。CTLA-4基因第1外顯子第17密碼子49位點為目前公認(rèn)的CTLA-4與GD相關(guān)的多態(tài)性位點之一，其余還有位于第一內(nèi)含子+1822位C/T等位基因等[7-8]，位于啟動子-318位點T/C等位基因和位于第四外顯子3'非翻譯區(qū)的+642位（AT）n可變重復(fù)序列等[9-11]。

國內(nèi)外關(guān)于CTLA-4基因CTLA-4基因第1外顯子第17密碼子49位點多態(tài)性與AITD的相關(guān)性的研究結(jié)論不盡相同，有研究發(fā)現(xiàn)兩者密切相關(guān)[2-3，12-13]，而Pastuszak等[14]研究則發(fā)現(xiàn)兩者并無相關(guān)性。王欒等[15]研究發(fā)現(xiàn)GD患者和HT患者CTLA-4基因第1外顯子的第17密碼子49位點G等位基因頻率均高于對照組。并且GD組和HT組按性別分層分析后發(fā)現(xiàn)該等位基因分布無性別差異。余綺玲等[16]對廣東地區(qū)漢族人群100例GD患者與100名健康人的CTLA-4基因G49基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)GD組GG基因型和G等位基因頻率較正常對照組顯著增高。解剖學(xué)研究，然而姚斌等[17]對廣東地區(qū)漢族人120例GD患者及123名正常人CTLA-4基因進(jìn)行研究后得出了相反的結(jié)論，其A49G位點的基因型、等位基因頻率也沒有表現(xiàn)出差異。

康毓芝等[18]研究發(fā)現(xiàn)寧夏地區(qū)GD患者組與對照組之間CTLA-4基因SNP （49）A/G的基因型分布具有統(tǒng)計學(xué)差異，GD組患者GG基因型和G等位基因頻率明顯升高。王淑瓊等[19]研究發(fā)現(xiàn)GD患者的CTLA-4第1外顯子的A/G49位點GG基因型頻率及G等位基因頻率較正常對照組顯著增高提示CTLA-4基因可能是漢族人群中GD的易感候選基因。朱凌燕等[20]對江西地區(qū)漢族人群99例GD患者和107例健康對照者CTLA-4基因第1外顯子第49位點的基因型進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GD患者GG純合子為46.47%，對照組GG純合子GG純合子為21.50%，兩者之間有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。

不同地區(qū)和種族的結(jié)果可能是抽樣誤差造成的，也可能是種族差異造成的。本研究檢測了82例GD患者，51例HT患者和80例健康人外周血CTLA-4基因第1外顯子的第17密碼子49位點的基因型并行分析，結(jié)果顯示GD組GG基因型的頻率及等位基因G的頻率明顯高于健康對照組（ X2=9.353，P=0.009； X2=7.548，P=0.006），而HT組GG基因型的頻率及等位基因G的頻率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ X2=0.062，P=0.969； X2=0.046，P=0.830）。提示攜帶 CTLA-4基因第1外顯子第17密碼子49位點GG基因型的個體發(fā)生GD的風(fēng)險明顯增加。本研究與國內(nèi)多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果相一致。

探討CTLA-4基因多態(tài)性與GD發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)的原因可能在于CTLA-4第1外顯子第17密碼子49位點的不同基因型影響到了CTLA-4蛋白的表達(dá)及功能，從而導(dǎo)致不同的個體自身免疫性疾病的易患性的差異。進(jìn)一步查證該基因序列發(fā)現(xiàn)，CTLA-4第1外顯子第17密碼子49位點單核苷酸基因多態(tài)性可導(dǎo)致該位點蛋白質(zhì)翻譯時出現(xiàn)蘇氨酸和丙氨酸的置換，而這種置換可能會出現(xiàn)CTLA-4蛋白表達(dá)減低和糖基化的效率降低的結(jié)果[12]，而且有研究發(fā)現(xiàn)該位點G等位基因的多態(tài)性可使甲狀腺抗體，甲狀腺球蛋白及甲狀腺過氧化物酶抗體滴度升高[13，21]。同時，它與其他多態(tài)性位點連鎖不平衡還可影響其mRNA的穩(wěn)定性。也有研究顯示G等位基因能減少CTLA4的表達(dá)，增加自身反應(yīng)性T細(xì)胞增殖，而AA基因型與GG基因型相比，刺激后在mRNA水平和蛋白水平都有更高的CTLA4 表達(dá)[2-3]。

本研究顯示，提示CTLA-4在此過程中起了重要的作用，然而要闡釋清楚CTLA-4在GD致病機(jī)制中究竟扮演何種角色，需要進(jìn)一步對其基因連鎖、免疫、蛋白表達(dá)等方面進(jìn)行更為深入的研究。

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