黃榮勛,譚小丹,陳涵,吳先輝
(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002;2.寧德職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 福建 福安 355000)
β-甘露聚糖研究進(jìn)展*
黃榮勛1,譚小丹1,陳涵1,吳先輝2
(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002;2.寧德職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 福建 福安 355000)
β-甘露聚糖(β-mannan)是植物體中一類常見(jiàn)的半纖維素多糖,有極佳的應(yīng)用前景,可作為流體流損抑制劑、絮凝劑、飼料輔助添加劑等,可應(yīng)用于造紙、紡織、化妝品、食品等各行業(yè)。但國(guó)內(nèi)的多糖研究起步慢,所以β-甘露聚糖的相關(guān)研究也較少。文章綜述了β-甘露聚糖的提取、分離、純化、鑒別等方法的研究進(jìn)展。
β-甘露聚糖;提??;分離純化;鑒別
β-甘露聚糖(β-mannan)是植物體中一類常見(jiàn)的半纖維素多糖,分類上,可將其分為4個(gè)子家族,分別為純甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖。β-甘露聚糖有著極高的利用價(jià)值,在多個(gè)行業(yè)中應(yīng)用廣泛。目前,國(guó)內(nèi)主要用于石油工業(yè)[1],作為流體流損抑制劑和絮凝劑;也可作為飼料輔助添加劑[2],代替動(dòng)物飼料中的抗生素;還可用于造紙、紡織、化妝品、食品等行業(yè)。但因國(guó)內(nèi)的多糖研究起步慢,所以β-甘露聚糖的相關(guān)研究也較少。
β-甘露聚糖的提取方法有機(jī)械法、浸提法、半濕法、酶法、超聲輔助提取法、超臨界流體萃取法等,一般的企業(yè)工廠化生產(chǎn)以機(jī)械法為主,能提供穩(wěn)定的生產(chǎn)質(zhì)量,同時(shí)降低成本。β-甘露聚糖的分離純化方法有sevage法、沉淀法、色譜法、膜法、透析等,sevage法較為常用,也有同時(shí)應(yīng)用多種方法進(jìn)行相關(guān)的分離純化。β-甘露聚糖的鑒別方法有紅外光譜法、核磁共振法、原子力顯微鏡觀察法、掃描電鏡測(cè)試法、X光衍射法、化學(xué)法等。
β-甘露聚糖的提取方法主要有幾種:機(jī)械法、半濕法、浸提法、酶法、超聲輔助提取法、超臨界流體萃取法。
機(jī)械法通常低成本、高效率,同時(shí)生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,普遍應(yīng)用于工業(yè)。但由于企業(yè)注重利益、國(guó)家投入開(kāi)發(fā)成本少,機(jī)械設(shè)備一直更新緩慢。一般常用的有壓榨機(jī)、研磨機(jī)等。周金湘[3]利用球磨及超聲波處理對(duì)米糠多糖提取的影響進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)將磨球質(zhì)量增加為2kg,米糠球磨5min后,多糖的提取率達(dá)到3.84%。在這之后,隨著球磨時(shí)間的增加,提取率則沒(méi)有發(fā)生較明顯的變化。何余堂[4]等人研究表明,機(jī)械破壁法明顯優(yōu)于溫差破壁法,且與酶解破壁法差異不明顯。機(jī)械破壁法易操作、成本低,被認(rèn)為適合在多糖提取中使用。分離提取玉米花粉多糖的最優(yōu)條件為:采取機(jī)械破壁法,料液比為1:6,浸提溫度為70℃,浸提時(shí)間2h。
當(dāng)提取原料浸泡處理長(zhǎng)時(shí)間不吸脹,無(wú)法很好的提取β-甘露聚糖時(shí),可使用半濕法。蔣建新[5]等人提出用半濕法分離提取無(wú)法吸脹的原料,且可利于提高提取率。具體流程依次為:原料、清雜、浸泡、脫水、氣流去濕、一次開(kāi)片、篩分、二次開(kāi)片、篩分、選片、膠片、水合、增粘、烘干、制粉、殺菌、膠粉包裝、成品入庫(kù)。且該法對(duì)原料大小、形狀等規(guī)則性要求不高;易操作,無(wú)粉塵飛揚(yáng),環(huán)境好;產(chǎn)品提取率高,品質(zhì)穩(wěn)定;不含化學(xué)試劑,生產(chǎn)過(guò)程無(wú)化學(xué)污染。
β-甘露聚糖可用水、酸、堿、有機(jī)溶劑等進(jìn)行粗提。已有許多學(xué)者用過(guò)該類方法,且可多個(gè)溶劑結(jié)合使用來(lái)提取多糖。該類方法需根據(jù)所提取β-甘露聚糖的存在部位,確定是否進(jìn)行預(yù)處理,再確定用何種溶劑進(jìn)行處理。
水提法是最常用的一種方法,一般采用熱水浸煮,然后對(duì)原料進(jìn)行β-甘露聚糖提取。但該法得到的提取液易變質(zhì),不易保存,且提取很耗時(shí),提取率低。劉紅芝[6]優(yōu)化了水提法制備甘露聚糖,確定其最佳條件:酵母菌體濃度為25%(w/w),在50℃、pH值6.5、3% NaCl的條件下,振蕩24 h,而后再將菌體洗凈,120℃處理3h。汪艷群[7]確定的提取五味子多糖的熱水浸提法的最佳工藝條件為:料液比1:40,提取溫度90.3℃,提取時(shí)間5h,五味子粗多糖的提取率為(10.99±0.22)%。
酸提法可針對(duì)某些在酸性條件下難以溶解的多糖進(jìn)行提取,提取的多糖在純度上比水提法要高,也可在一定程度上提高多糖提取率。一般采用弱酸將提取液制成酸性,再用有機(jī)溶劑將多糖析出,或加入鹽類使得多糖析出。侯然然[8]確定了用檸檬酸緩沖液提取廢酵母泥中的葡甘露聚糖的最佳提取條件為:檸檬酸緩沖液pH值7.0、提取溫度120℃、提取時(shí)間90min,提取重復(fù)2次。Huang G. L.[9]等人研究表明:鹽酸法展現(xiàn)出最高地脫蛋白率,損失率只比sevage法、三氯乙酰酸法略高一些。任初杰[10]等人研究了花生粕多糖酸提法的工藝:用鹽酸提取花生粕,以10000r.min-1離心15min,再取離心后的上清液,加入3倍95%乙醇進(jìn)行沉淀,過(guò)夜之后,再以10000 r.min-1離心15min,然后將沉淀用0.1mol.L-1鹽酸溶解。
堿提法是與酸提法在原理上相似的一種方法。一般用弱堿進(jìn)行提取,根據(jù)原料的不同而定制不同的溫度和提取次數(shù)、時(shí)間。劉紅芝[6]確定了堿提法制備酵母甘露聚糖的最佳條件為:KOH濃度2%、溫度100℃、反應(yīng)時(shí)間2 h。張?zhí)m杰[11]等人用稀NaOH將pH調(diào)到8,再用水溶液重復(fù)提取3次,濾液分離純化后,得到2種多糖,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.387%和0.061%。
利用酶反應(yīng)分解原料,除去雜質(zhì),促使極性低的脂溶成分轉(zhuǎn)化成水溶成分,可在一定程度上降低提取的難度。唐存多[12]確定了酶法水解魔芋精粉提取低聚甘露糖的條件:魔芋膠溶液30g·L-1,加入酶量60U·g-1魔芋精粉,溫度60℃,水解6h,在此條件下水解率為36.6%。賀寅[13]等人確定了酶解龍眼多糖最佳工藝條件:酶添加量1.2%、液料比6:1(mL.g-1)、酶解溫度45.0℃、酶解時(shí)限187.0min。在此條件下,酶法提取龍眼多糖的得率為(12.23±0.15)mg.g-1,比起浸提法有更高的多糖得率。
利用超聲的機(jī)械作用,可破壞原料細(xì)胞壁,加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)傳輸,從而提高多糖提取速度。在溶液中,超聲使得液體介質(zhì)反復(fù)伸縮,在拉伸時(shí)讓液體撕裂成類真空的空洞,在收縮時(shí)空洞崩解產(chǎn)生局部高溫、放電現(xiàn)象。進(jìn)而破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),使細(xì)胞破裂,瞬間將細(xì)胞內(nèi)的活性成分釋放。超聲輔助提取法比起一般的浸提法可保證較高的提取率,也可與其它方法聯(lián)用。張琳[14]優(yōu)化了超聲輔助提取法聯(lián)合酶法制備魔芋低聚糖的工藝條件:魔芋膠濃度80g.L-1,pH為自然pH,溫度55℃,加入酶量0.168%、超聲功率為76.08W、超聲時(shí)間14min。姚以才[15]等人確定超聲輔助提取蘆根多糖的最佳工藝條件:液料比9.9:1(mL.g-1) 、超聲溫度60℃、超聲時(shí)間52min,此時(shí)蘆根多糖得率9.06%。
超臨界流體萃取法是一種使物質(zhì)處于臨界溫度和臨界壓力的條件下,同時(shí)具有液相和氣相的性質(zhì),從而極大提高溶解度,使得物質(zhì)滲入到提取材料中,再通過(guò)減壓,達(dá)到萃取目的。一般常用CO2作為萃取溶劑。朱俊玲[16]確定的超臨界CO2流體萃取蘆薈多糖的最佳工藝條件是:乙醇用量為250mL. (100g)-1蘆薈、萃取壓力為25MPa、萃取溫度為35℃。任美玲[17]確定最優(yōu)竹葉多糖提取工藝條件:萃取溫度55℃,壓力40MPa,提取時(shí)間2h,夾帶劑體積與竹葉質(zhì)量比為3:1。實(shí)測(cè)4種竹葉多糖超臨界CO2提取物多糖含量:毛竹13.311%、苦竹24.333%、綠竹29.894%、黃甜竹15.014%。采用超臨界流體萃取技術(shù)提取竹葉多糖得率明顯高于傳統(tǒng)的水提法、溶劑提取法、酶法、微波提取法,且提取效率高、成本低、無(wú)污染。
去蛋白的方法有Sevage法、三氯乙酸法、三氯乙酸-正丁醇法等。
2.1.1 Sevage法:蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中易發(fā)生變性,利用這個(gè)特點(diǎn),在充分變性沉淀后再離心去除蛋白蛋。該法能防止多糖降解,但在效率上表現(xiàn)欠佳,需多次反復(fù),會(huì)損失部分多糖。王艷立[18]的研究中表明采用Sevage法純化脫蛋白效果最好,可使多糖含量達(dá)到88.95%。張萍[19]等人確定石榴皮多糖的最佳脫蛋白工藝條件為:Sevage試劑中氯仿與正丁醇的比為4:1、試劑加入量為多糖溶液體積的1/3、震搖時(shí)間為25 min、脫蛋白1次,蛋白脫除率達(dá)88.46%,多糖損失率為8.05%。扈瑞平[20]等人確定了Sevage法去除沙蔥多糖蛋白的最佳工藝條件為:Sevage試劑添加量為1/4,氯仿-正丁醇體積比為3:1,除蛋白時(shí)間為30min。
2.1.2 三氯乙酸法:三氯乙酸能與多糖提取液中的蛋白質(zhì)發(fā)生作用,而變性沉淀。一般是在多糖水提液中滴加等體積的5%~10%三氯乙酸,然后充分?jǐn)嚢韬箪o置,再過(guò)夜,離心除去沉淀,接著反復(fù)執(zhí)行以上操作,直到水提液中無(wú)混濁為止,可得到無(wú)蛋白質(zhì)的多糖。孫茜[21]的研究表明,在純化胡蘆巴半乳甘露聚糖時(shí),三氯乙酸法脫蛋白效果優(yōu)于Sevage法。
2.1.3 三氯乙酸-正丁醇法:方升平[22]等人確定了最佳的除蛋白方法:Sevage法的蛋白質(zhì)去除率在90%以上,但多糖回收率僅為40%;三氯乙酸法的蛋白質(zhì)去除率為37.28%,多糖回收率為73.19%;三氯乙酸-正丁醇法的蛋白質(zhì)去除率為83.60%,多糖回收率為85.16%,且操作簡(jiǎn)便、高效。因此,三氯乙酸-正丁醇法除蛋白效果較好。汪艷群[7]研究表明,最佳脫蛋白方法為酶法與三氯乙酸-正丁醇法結(jié)合,酶解條件為:蛋白酶用量為1%、酶解溫度為50℃、酶解時(shí)間為140min、pH值為5,酶解后用三氯乙酸-正丁醇法處理4次,可除去蛋白質(zhì),多糖保留率為68.3%。
多糖的分離方法主要有沉淀法、色譜法、膜法、透析等。
2.2.1 沉淀法:因大部分多糖可溶于水,碳數(shù)越多溶解度越低,利用這個(gè)特性,且低碳的多糖還可溶于乙醇,制作一個(gè)乙醇體積濃度差,使得不同碳數(shù)的多糖分層析出。也可采用硫酸銨沉淀或者硫酸銨分級(jí)沉淀法來(lái)去除蛋白[23],硫酸銨分級(jí)沉淀法與硫酸銨單步沉淀相比,提取率較低,但能得到較高的純化倍數(shù)。謝愛(ài)澤[24]等人確定了丙酮沉淀法的最佳工藝條件為:離心時(shí)間為15min,丙酮加入量為20ml、沉淀時(shí)間為12h,在此條件下的所得粗茶多糖含量為0.0037g。劉悅[25]等人確定的較優(yōu)的提取條件為:提取時(shí)間60min,蒸餾水與茶葉的液固比30:1,浸提溫度60~70℃,提取次數(shù)3次,茶多糖的提取率達(dá)2.120%。黃家偉[26]等人確定了丙酮沉淀法提取杠板歸多糖的最佳工藝條件:丙酮加入量75ml、沉淀時(shí)間18h和離心時(shí)間18min。江新鳳[27]等人確定乙醇沉淀法提取茶花多糖的最佳工藝條件:濃縮液與沉淀劑的比例為1:3、沉淀時(shí)間為6h、提取次數(shù)為2次。
2.2.2 色譜法:常用凝膠柱色譜法、離子色譜法。凝膠柱色譜法,邵靜可[28]在研究中利用凝膠色譜分離法從魔芋飛粉中分離出魔芋甘露聚糖肽,在最佳發(fā)酵工藝條件下,魔芋甘露聚糖多肽的最高得率為5.78%。齊曉輝[29]采用離子交換色譜法和凝聚滲透色譜法對(duì)滸苔多糖的粗多糖進(jìn)行分離純化,主要得到4個(gè)多糖組分QC1S、QCQ2、QCQ3和QHS,總糖含量分別為52.2%、42.4%、51.0%和55.6%。陳英紅[30]等人利用高效液相色譜法建立銀耳多糖特定圖譜,經(jīng)過(guò)分析,圖譜由6個(gè)共有峰組成,為木糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸以及1個(gè)未鑒定出的單糖。周鑫玉[31]在體系的上相為固定相,下相為流動(dòng)相,主機(jī)轉(zhuǎn)速為800rpm,流動(dòng)相流速0.8mL. min-1,分離溫度30℃的條件下,用高速逆流色譜法從0.4g石榴皮多糖提取物中成功分離獲得10.7mg的PGP-1,4.7mg的PGP-2和15.6mg的PGP-3。
2.2.3 膜法:即膜分離技術(shù)(membrane separation technology,MST)[18],以選擇透過(guò)性膜作為分離介質(zhì),在膜兩側(cè)施加一定動(dòng)力,一般是利用壓力或電位形成壓力差或電位差,強(qiáng)迫溶液中的物質(zhì)選擇性地透過(guò)膜。目前多使用超濾、微濾技術(shù)。婁廣慶[32]的研究確定了最佳制備魔芋葡甘露低聚糖實(shí)驗(yàn)條件:加入酶量2.6%,pH為4.84,料液比1%。經(jīng)超濾分離,魔芋葡甘露低聚糖得率為9.81%。譚永輝[33]對(duì)水溶性大豆多糖純化效果進(jìn)行乙醇沉淀法和超濾法的比較研究,結(jié)果表明:乙醇沉淀法的得率和脫色率分別為88.9%和93.1%;超濾法的得率和脫色率分別是分別為81.8%和90.1%。雖然超濾法的純化效果稍差,但它有一定的分離和濃縮作用,較適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
β-甘露聚糖的鑒別方法有紅外光譜法、核磁共振法、原子力顯微鏡觀察法、掃描電鏡測(cè)試法、X光衍射法、化學(xué)法等。
紅外光譜法是利用紅外光譜分析儀得出分析圖譜,進(jìn)而分析出多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的一種方法。鐘紀(jì)育[34]證明了半乳甘露聚糖具有一定的特征吸收峰,說(shuō)明了用紅外光譜法對(duì)多糖進(jìn)行鑒別是準(zhǔn)確可靠的。吳先輝[35]等用紅外光譜法分析出GGM分子鏈在3352、2930、1639、1354、1230、1028 cm-1出現(xiàn)特征吸收峰。Soren Barsberg[36]等人將紅外光譜與衰減全反射結(jié)合起來(lái),當(dāng)作一種全新的方法進(jìn)行甘露聚糖和纖維素的振動(dòng)特性的研究分析。夏朝紅[37]等人研究了殼聚糖、葡聚糖、茯苓多糖、魔芋甘露聚糖等多糖的紅外光譜,研究結(jié)果表明,葡聚糖為α-多糖,其余均為β-多糖。紀(jì)鵬[38]用紅外光譜分析各種當(dāng)歸炮制品中酸性多糖成分,結(jié)果為:含量從高到低依次為油當(dāng)歸多糖、當(dāng)歸炭多糖、土當(dāng)歸多糖、生當(dāng)歸多糖、酒當(dāng)歸多糖。吡喃環(huán)糖成分,結(jié)果為:含量從高到低依次為生當(dāng)歸多糖、油當(dāng)歸多糖、土當(dāng)歸多糖、當(dāng)歸炭多糖、酒當(dāng)歸多糖。常靜[39]等人研究表明:不同等級(jí)靈芝的紅外光譜圖基本相似,峰形相同;所選定的吸光度變量與靈芝多糖含量之間的相關(guān)性顯著,靈芝多糖含量的預(yù)測(cè)模型及其檢驗(yàn)結(jié)果有顯著水平的擬合度。說(shuō)明可用紅外光譜法來(lái)預(yù)測(cè)靈芝多糖含量。
劉玉紅[40]等人在做核磁共振應(yīng)用的綜述中小結(jié)到,高磁場(chǎng)核磁共振儀大幅提高了譜峰的分辨率,可提供多糖結(jié)構(gòu)中單糖殘基的類型、C、H化學(xué)位移歸屬、殘基間的連接位置和順序、或可提供某些多糖結(jié)構(gòu)的全部信息。吳先輝[35]等人用核磁共振法鑒定GGM單糖分子為鏈狀,鏈狀分子非直線形,而是具有高度螺旋、折疊、卷繞、分支的化學(xué)結(jié)構(gòu)。單鏈的厚度小于2.8 nm,長(zhǎng)度為50 nm-2μm,寬度為10-40 nm;GGM分子鏈結(jié)構(gòu)存在α構(gòu)型和β構(gòu)型糖甘鍵。Cizova Alzbeta[41]等人用NMR觀察到白念球菌在超聲波處理下,聚合結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。杜秀菊[42]等人闡述了核磁共振波譜技術(shù)(2D-NMR)在多糖結(jié)構(gòu)鑒定中的作用,并提供了糖殘基數(shù)的確定、糖環(huán)構(gòu)型的確定、異頭構(gòu)型的確定、單糖殘基H和C的化學(xué)位移的歸屬、連接位置和連接順序的確定、取代基的確定等過(guò)程中,會(huì)出現(xiàn)的相關(guān)的規(guī)律及幫助確定結(jié)構(gòu)大致的方法。
已有學(xué)者運(yùn)用原子力顯微鏡觀察法,對(duì)多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)觀察。吳先輝[35]等用原子力顯微鏡觀測(cè)到云杉中半乳葡甘露聚糖大分子呈多分枝結(jié)構(gòu)。鄭潔等人[43]在對(duì)原子力顯微鏡應(yīng)用的綜述上指出,原子力顯微鏡可對(duì)多糖分子進(jìn)行尺寸、表征的觀測(cè),可進(jìn)一步對(duì)多糖的性質(zhì)進(jìn)行研究,但須注意緩沖溶液對(duì)觀測(cè)的影響。孫潤(rùn)廣[44]等人用原子力顯微鏡(AFM)對(duì)甘草多糖的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,結(jié)果表明:甘草多糖主要由葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖組成。甘草多糖分子具有高度分枝的結(jié)構(gòu),并且糖鏈間形成環(huán)狀、柱狀或近似于螺旋狀的結(jié)構(gòu)。這種現(xiàn)象可能與該多糖中分子間的范德華力相互作用以及糖鏈間的氫鍵締合有關(guān)。徐平平[45]等人用原子力顯微鏡對(duì)女貞子多糖結(jié)構(gòu)形態(tài)進(jìn)行觀測(cè),分析表明:LL-Ⅰ1、LL-Ⅰ2、LL-Ⅲ分別不同程度的聚集成股,且具有螺旋結(jié)構(gòu)。這種現(xiàn)象可能與聚集體的分子間相互作用和糖鏈間的氫鍵締合有關(guān)。
吳先輝[35]等人用掃描電鏡對(duì)樣品進(jìn)行分析,放大倍數(shù)從500倍至10000倍,觀察中可看到較為清晰的GGM形貌,呈團(tuán)簇狀、小球狀,外表有線狀絨毛。秦利鴻[46]等人利用掃描電鏡(SEM)和原子力顯微鏡(AFM)對(duì)綠茶多糖及酶解綠茶多糖試樣進(jìn)行顯微成像,得到顆粒狀或由單個(gè)顆粒聚集成的形貌結(jié)構(gòu)。研究表明:改進(jìn)制樣方法的掃描電鏡觀察結(jié)果與原子力顯微鏡成像基本一致,說(shuō)明改進(jìn)后的掃描電鏡制樣法是一種簡(jiǎn)單有效的方法。
β-甘露聚糖的應(yīng)用范圍非常廣泛,有很好的應(yīng)用前景,人們對(duì)其的關(guān)注程度也在逐漸提高。β-甘露聚糖的提取手段,在不斷更新進(jìn)步的同時(shí),提取的條件、成本也在不斷的提高,但提取的純度提高有限,需要進(jìn)行更多的探究。分離純化的方法已經(jīng)比較成熟。鑒別的方法也很多,融合使用多種方法能更加準(zhǔn)確的得出結(jié)果。另外,在制作糖膠時(shí),要注意品質(zhì)的問(wèn)題,以及影響的因素,并利用改性改變粘度低的問(wèn)題,改性的方法仍然有可開(kāi)發(fā)之處。隨著科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展,許多方法已經(jīng)走向標(biāo)準(zhǔn)化,相信在不久的將來(lái),會(huì)開(kāi)發(fā)出更多成本低、效率高、效果顯著、操作簡(jiǎn)便的最佳方法。
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TS202
A
1007-550X(2015)09-0042-07
10.3969/j.issn.1007-550X.2015.09.001
福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014J01384),福建省林業(yè)廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(No20135)。
2015-07-25
黃榮勛(1990-),男,福建三明人,碩士生,主要從事魔芋葡甘聚糖的結(jié)構(gòu)與功能研究。
吳先輝,副教授, E-mail:wxh6390026@126.com