許天源，朱照偉，夏磊磊，王先進(jìn)，秦 亮，張 祥，沈周俊

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科，上海 200025）

膀胱癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國(guó)泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中居于首位。動(dòng)物模型是體內(nèi)研究膀胱癌發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、化療抵抗機(jī)理及新型治療方法的主要途徑，其中使用亞硝基類致癌劑是誘發(fā)原位膀胱腫瘤的重要膀胱癌動(dòng)物建模手段［1］。由于原位膀胱腫瘤生長(zhǎng)在肉眼不可直視的膀胱腔內(nèi)，因此活體檢測(cè)對(duì)動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)具有重要意義。我們?cè)趪?guó)內(nèi)首次報(bào)道了膀胱癌大鼠的活體CT檢測(cè)方法，對(duì)評(píng)判建模效果具有良好的指導(dǎo)價(jià)值［2］。盡管如此，這種單純CT平掃的成像對(duì)比度欠佳，且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物目標(biāo)較小，檢測(cè)靈敏度有待提升。此外CT作為一種平面成像手段，無(wú)法提供直觀、精準(zhǔn)的病灶定位和形態(tài)信息。CT尿路成像（CT urography，CTU）作為臨床上一種高效的膀胱癌影像學(xué)診斷技術(shù)，彌補(bǔ)了上述缺點(diǎn)，值得在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中參考。有鑒于此，本課題組提出了一種改良的膀胱癌大鼠CT檢測(cè)方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了CTU三維重建，取得了很好的檢測(cè)效果?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 造模試劑N－甲基－N－亞硝脲（MNU）（2g瓶裝混合物，純度50%）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。枸櫞酸緩沖液的配置：枸櫞酸4.2g，氫氧化鈉2.1g，加經(jīng)高壓滅菌的去離子240mL水振搖溶解，用5mol／L濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.0，再加去離子水至250mL搖勻，分裝、密封后4℃保存。將緩沖液50mL注入MNU瓶中，配置成濃度20mg／mL的MNU溶液，3mL分裝后置于－80℃冰箱保存。CT掃描用InveonmicroPET／CT顯像儀（西門子公司，德國(guó)），檢測(cè)中使用碘造影劑歐乃派克（通用電氣藥業(yè)上海有限公司，中國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型構(gòu)建 建模動(dòng)物選用10～12周齡無(wú)特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級(jí)雌性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿prague Dawley，SD）大鼠，體重190～220g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心飼養(yǎng)［SCXK（滬）2011－0113］。飼養(yǎng)條件：SPF級(jí)獨(dú)立盒籠系統(tǒng)，常規(guī)飲食，12h晝夜節(jié)律，濕度50%～60%，溫度24～27℃。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則對(duì)大鼠給予人道的關(guān)懷，方案經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

取大鼠30只隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組（A組）10只，造模組（B組）20只。A組以枸櫞酸鈉緩沖液0.1 mL每2周膀胱灌注1次，共4次：每次給藥前2%50 mg／kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，仰臥固定并消毒會(huì)陰，取潔凈硬脊膜外麻醉導(dǎo)管（直徑1mm，長(zhǎng)度6 cm），石蠟油潤(rùn)滑后經(jīng)尿道置管，尿液流出提示插入膀胱；抽盡膀胱尿液并注入枸櫞酸鈉緩沖液0.1mL（注射器推至盡頭后拔出、抽吸少量空氣，再連接導(dǎo)管將導(dǎo)管中的殘余液體全部注入大鼠膀胱），拔除導(dǎo)尿管后粗絲線扎住尿道外口，大鼠平臥2h解除絲線等待麻醉清醒。B組以A組同法經(jīng)膀胱灌注配置好的MNU溶液0.1mL（2mg）。兩組大鼠誘癌期結(jié)束后均常規(guī)飼養(yǎng)，觀察大鼠一般情況。

1.3 改良的CT及CTU檢測(cè) 活體檢測(cè)在14周時(shí)進(jìn)行。我們?cè)诩韧笫驝T檢測(cè)［2］的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)方法做了改良：大鼠麻醉后經(jīng)自制導(dǎo)尿管注入1～1.5mL歐乃派克稀釋液（100mg／mL）使膀胱充盈，隨后固定在CT機(jī)上。CT掃描層厚1.5mm，橫軸位、矢狀位、冠狀位均進(jìn)行掃描。利用上述數(shù)據(jù)，進(jìn)一步通過(guò)多平面重建、最大密度投影、曲面重建和容積再現(xiàn)等技術(shù)，對(duì)大鼠的下尿路進(jìn)行CTU三維重建。

1.4 病理組織學(xué)分析 活體檢測(cè)后（14周末）處死所有大鼠，肉眼觀察膀胱成瘤情況；取新鮮膀胱組織，10%甲醛溶液固定24h，脫水，石蠟包埋，切片4～5 μm，HE染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用s進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。組間比較計(jì)量資料采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)中，A組大鼠1只因首次膀胱灌注時(shí)麻醉過(guò)量死亡。B組大鼠死亡2只，1只因首次膀胱灌注時(shí)麻醉過(guò)量死亡，1只于第6周時(shí)死亡，尸體解剖可見(jiàn)腎膿腫形成。兩組大鼠平均初始體重相近［（205±10）g vs.（207±11）g］；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠活動(dòng)正常，14周時(shí)A組存活大鼠平均體重略高于B組［（319±15）g vs.（308±21）g］，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。B組大部分大鼠于第7周后陸續(xù)出現(xiàn)肉眼血尿。

2.2 建模效果與病理組織學(xué)特征 14周末處死所有存活大鼠。肉眼下A組大鼠均未見(jiàn)成瘤，膀胱黏膜光滑、壁薄、厚度均勻、血管紋理清晰。B組大鼠成瘤17只（94%），膀胱腫瘤呈米粒樣、乳頭狀、菜花狀或團(tuán)塊狀，膀胱壁可見(jiàn)不同程度的增厚；部分大鼠伴膀胱結(jié)石及輸尿管積水。所有大鼠均未見(jiàn)肝腎、淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移。

兩組大鼠的肉眼及鏡下典型組織病理特征如圖1所示。A組大鼠膀胱黏膜均為3～4層移行上皮細(xì)胞組成，細(xì)胞大小均一，排列有序，核圓；B組大鼠成瘤病理類型均為尿路上皮癌，膀胱腫瘤細(xì)胞大小不一，層次明顯增多，細(xì)胞排列紊亂，極性消失，核畸形，染色質(zhì)呈粗顆粒狀，常堆積于核膜下，核漿比例大，可見(jiàn)不同程度的核分裂像。

2.3 大鼠CT檢測(cè)結(jié)果 改良的CT成像如圖2所示，膀胱腔內(nèi)含碘的歐乃派克稀釋液呈高信號(hào)，與周圍中低信號(hào)的膀胱壁及腫瘤組織對(duì)比鮮明。正常大鼠膀胱內(nèi)腔呈橢圓形高密度影，邊界清晰光整，周圍膀胱壁厚薄均一；膀胱癌大鼠可見(jiàn)乳頭狀、團(tuán)塊狀等大小不等的低信號(hào)隆起凸向膀胱腔形成充盈缺損，膀胱壁厚薄不均，局部可見(jiàn)增厚。利用該方法成瘤大鼠全部檢出，檢出率100%。

2.4 大鼠CTU檢測(cè)結(jié)果 利用CT掃描數(shù)據(jù)，我們進(jìn)一步進(jìn)行了大鼠膀胱CTU三維重建（圖2）：正常膀胱呈光滑的橢球形，左右輸尿管及下方尿道均顯影清晰；膀胱新生物表現(xiàn)為橢球表面大小不同、形狀各異的凹陷，邊界、位置清晰。

圖1 兩組大鼠膀胱的肉眼及鏡下組織病理學(xué)特征

圖2 兩組大鼠CT及CTU圖像

3 討 論

化學(xué)致癌法用于原位膀胱癌建模有以下優(yōu)勢(shì)：①尿路上皮選擇性；②周期短、誘癌率高；③與人類膀胱癌發(fā)生的自然規(guī)律和病理類型相似；④實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求低［3］。因此該方法在膀胱癌研究中應(yīng)用廣泛，其中MNU為代表的亞硝基類化合物最為常用。MNU是直接致癌劑，通過(guò)鳥(niǎo)嘌呤烷化引起DNA損傷誘發(fā)膀胱腫瘤，需經(jīng)尿道膀胱灌注給藥，適用于雌性大、小鼠。既往研究采用相同給藥方法，膀胱灌注3周出現(xiàn)不典型增生，6～7周出現(xiàn)原位癌，9周可見(jiàn)癌性腫塊，12～14周為膀胱乳頭狀癌或浸潤(rùn)性癌［4－5］。本研究與上述報(bào)道一致，14周時(shí)大鼠成瘤率94%，鏡下新生物為尿路上皮癌，部分腫瘤見(jiàn)肌層浸潤(rùn)，病理特征與人膀胱癌相似。可見(jiàn)MNU誘導(dǎo)大鼠膀胱癌是一種可靠、高效的建模方法。

由于MNU需經(jīng)膀胱灌注給藥，規(guī)范化操作對(duì)保證建模效果特別重要。實(shí)驗(yàn)組非腫瘤因素死亡2例，分別為首次麻醉過(guò)量和逆行尿路感染引起的腎膿腫。為了減少意外致死，給藥時(shí)須注意控制麻醉劑量、防止大鼠窒息；術(shù)前器械滅菌、會(huì)陰部消毒以減少尿路感染；術(shù)中導(dǎo)尿管置入不宜過(guò)深，避免粗暴操作損傷尿路；還可經(jīng)飲水給予大鼠抗生素，不僅可預(yù)防感染及膀胱結(jié)石，還減少了非尿路上皮腫瘤的發(fā)生［6］。另一方面，為了提高成瘤率、減少大鼠成瘤的異質(zhì)性，也應(yīng)保證麻醉深度、輕柔置管以減少膀胱收縮，同時(shí)術(shù)后牢固結(jié)扎尿道外口，防止MNU溶液漏出；術(shù)前6～8h禁水有利于提高膀胱內(nèi)MNU的濃度。

由于動(dòng)物模型建立后常需繼續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，因此需要非處死的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體檢測(cè)方法來(lái)確定建模效果。對(duì)于大鼠原位膀胱癌模型，有以下幾種可能的方法：下腹部觸診極為簡(jiǎn)便，但這種方法不能評(píng)判膀胱腫瘤的具體情況，且只有質(zhì)量超過(guò)200mg的新生物可被觸及，并不可靠［7］；麻醉解剖觀察后再縫合，該方法創(chuàng)傷較大，容易導(dǎo)致感染、腫瘤種植甚至致死，對(duì)腫瘤特征和后續(xù)研究結(jié)果也可能產(chǎn)生影響；尿脫落細(xì)胞檢測(cè)無(wú)創(chuàng)簡(jiǎn)便，但陽(yáng)性率過(guò)低［8］；核磁共振也可以用于檢測(cè)大鼠膀胱腫瘤，但較為昂貴，與CT等方法相比并無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)［9］；既往研究還利用SPECT顯像進(jìn)行活體檢測(cè)，但該方法具有放射性，且耗時(shí)較長(zhǎng)［5］。我們?cè)状螆?bào)道了CT對(duì)大鼠原位膀胱癌檢測(cè)的價(jià)值，該方法直接方便、準(zhǔn)確靈敏［2］。盡管小動(dòng)物CT有較好的檢出率，但平掃下膀胱壁及腫瘤組織呈等密度或低密度，與腔內(nèi)生理鹽水暗區(qū)對(duì)比并不十分明顯，對(duì)微小病變（0～2mm）的識(shí)別效果不能保證。為此我們進(jìn)一步改良，提出了CT平掃聯(lián)合碘造影劑膀胱灌注的新方法，大鼠膀胱內(nèi)腔呈高密度影，與周圍膀胱新生物及正常組織對(duì)比鮮明，腫瘤邊界、位置清晰。這種方法一定程度上彌補(bǔ)了小動(dòng)物CT空間分辨率低、層厚不足的缺陷，更有利于發(fā)現(xiàn)膀胱微小病變（直徑1mm的顆粒樣腫塊），大鼠膀胱癌檢出率高達(dá)100%，還可利用影像進(jìn)行腫瘤負(fù)荷定量評(píng)價(jià)。

事實(shí)上，本研究中改良CT的鑒定方法與臨床CTU檢查極為相似。CTU基于圖像三維重建技術(shù)，正逐步取代傳統(tǒng)靜脈尿路造影受到醫(yī)生的青睞。本研究中，我們將復(fù)雜的靜脈注射造影劑改良為膀胱灌注給藥，CT尿路三維重建效果與臨床CTU相似，由此提出了一種“小動(dòng)物CTU”檢測(cè)方法。通過(guò)圖像處理軟件，可以去除多余骨骼、肌肉及臟器疊影，并對(duì)三維圖像進(jìn)行任意旋轉(zhuǎn)，包括輸尿管下段、膀胱及尿道在內(nèi)的大鼠下尿路得到立體呈現(xiàn)；在腫瘤檢出方面，CTU彌補(bǔ)了二維平面成像的不足，實(shí)現(xiàn)了病灶形態(tài)與位置的精確描述，腫瘤負(fù)荷也可得到計(jì)算。與CT相比，這種方法更為全面和直觀，有利于膀胱癌動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)和治療效果的連續(xù)觀測(cè)；若今后需開(kāi)展上尿路或尿道原位腫瘤的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，CTU無(wú)疑更具活體檢測(cè)價(jià)值。

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