吳寶紅，樊汶樵，姜玉松，張 婷，孫翰昌，徐敬明

（重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護(hù)與開發(fā)研究中心，重慶永川402168）

金黃桿菌感染棘腹蛙的分離鑒定

吳寶紅，樊汶樵，姜玉松，張 婷，孫翰昌，徐敬明

（重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護(hù)與開發(fā)研究中心，重慶永川402168）

棘腹蛙又名石坑、石蛙等，隸屬無尾目、蛙科、棘蛙屬，是我國特有的珍稀兩棲動物［1］，主要分布在湖南、湖北、四川以及甘肅等?。?］。由于環(huán)境污染嚴(yán)重、野生棲息地遭受破壞、人類大肆捕殺，棘腹蛙野生種群數(shù)量大量減少［3］。為保護(hù)其野生資源，同時滿足市場需求，棘腹蛙的人工養(yǎng)殖逐漸受到重視。2014年以來，重慶地區(qū)部分養(yǎng)殖場出現(xiàn)大量棘腹蛙出血死亡的病例，給棘腹蛙養(yǎng)殖帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究擬從患病棘腹蛙體內(nèi)部分器官分離病原菌，對其進(jìn)行生物學(xué)特性研究和藥敏試驗，為該病的診斷與防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料及供試材料來源患病棘腹蛙為重慶市某養(yǎng)殖場送檢樣品，平均體重100.0±2.0 g，平均體長40.0±2.0mm?；疾〖雇苁沉繙p少、動作遲緩，嚴(yán)重患蛙死亡。剖檢可見眼球化膿，上頜、食道表面、腹腔皮下、輸卵管均嚴(yán)重出血，肝臟暗黑色并有多處出血點(diǎn)，脾臟和肺部發(fā)黑，十二指腸充血、出血。

健康棘腹蛙，購自重慶某棘腹蛙養(yǎng)殖場，共80只，規(guī)格為每只體重100 g左右，平均體長45mm左右。

1.2 試劑、藥物、培養(yǎng)基及器材酵母提取物、胰蛋白胨等試劑，購自O(shè)XOID公司；水解酪蛋白（M-H）瓊脂/肉湯，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；兔血在無菌條件下采自健康家兔；細(xì)菌微量生化管（批號：140123）和藥敏試紙（批號：140227），購自杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、2× Taq PCR Master Mix等，購自天根生化科技（北京）有限公司；其他常規(guī)試劑由實驗室自行配置。

1.3 病原菌的分離無菌接種病蛙眼部病灶、上頜、腹腔皮下及心臟、脾臟等器官于LB固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h；同時做厭氧培養(yǎng)，觀察細(xì)菌生長情況。對優(yōu)勢菌進(jìn)行純化并革蘭染色鏡檢觀察，同時用5%兔全血平板鑒定其溶血性。純化后的候選菌株加入25%甘油置-20℃保存。1.4致病性試驗挑取單個菌落于LB液體培養(yǎng)基中，120 r/min（28℃）震蕩培養(yǎng)12 h。用平板菌落計數(shù)法調(diào)整菌懸液濃度至1.1×107、1.1×106、1.1× 105、1.1×104、1.1×103、1.1×102、1.1×101CFU/mL。將健康棘腹蛙隨機(jī)分成8組，每組10只，暫養(yǎng)1周后對其中7組腹腔注射不同濃度菌液，每只0.2mL；最后1組注射生理鹽水0.2mL作為對照。隨時觀察并記錄感染情況，同時取人工感染后死亡棘腹蛙內(nèi)臟組織進(jìn)行細(xì)菌的再分離培養(yǎng)。

1.5 生理生化特性鑒定取純化后的單個菌落，接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管進(jìn)行生理生化特性測定，參照《伯杰氏細(xì)菌手冊》進(jìn)行判定結(jié)果。

1.6 16S rDNA基因序列分析選取純化后單個菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中以獲得細(xì)菌懸液并提取細(xì)菌基因組DNA，采用擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的通用引物（fD1/rD1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（上、下游引物分別為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后的陽性產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。

將陽性產(chǎn)物序列與GenBank中的已知序列進(jìn)行Blast對比，篩選出相似性較高的序列，利用Mega6.0軟件進(jìn)行多序列匹配分析，鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［4］。

1.7 藥敏試驗挑取純化后的候選菌株單個菌落于M-H肉湯中，28℃恒溫震蕩培養(yǎng)12 h。將菌懸液用生理鹽水稀釋為0.5倍麥?zhǔn)蠞舛群?，用棉拭子蘸取菌液均勻涂布在M-H培養(yǎng)基表面，然后用鑷子將藥敏紙片緊貼在瓊脂平板表面。每張紙片間距≥24mm，紙片中心距平皿邊緣≥15 mm。28℃恒溫培養(yǎng)12～18 h后觀察細(xì)菌生長情況，測量抑菌圈大小，并參照藥敏試驗判斷標(biāo)準(zhǔn)來判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果及培養(yǎng)特性在患病棘腹蛙眼球、脾臟、食道和肺均分離到一株相同的優(yōu)勢菌。該候選菌株好氧，在LB固體培養(yǎng)基上呈表面光滑、突起的圓形菌落，具有金黃色色素。生長12 h后，菌落互相粘連，培養(yǎng)基表面完全被粘連的菌絲覆蓋；在兔全血平板上無溶血環(huán)出現(xiàn)。革蘭染色可觀察到短桿狀、無鞭毛、無芽孢的革蘭陰性菌；將該純化菌株命名為CQWU201410。

2.2 致病性試驗結(jié)果候選菌株CQWU201410人工感染4 d后棘腹蛙開始死亡，眼觀可見1.1× 104及以上感染組棘腹蛙出現(xiàn)眼球化膿，腹部嚴(yán)重收縮等癥狀，剖檢癥狀與自然發(fā)病一致；對照組無任何異常。從感染病蛙的眼球、食道、脾臟和肺仍能分離出與自然發(fā)病相同的優(yōu)勢菌。根據(jù)改良寇氏法［5］可計算出候選菌株CQWU201410感染棘腹蛙的半致死劑量LD50為1.743×104CFU/只，結(jié)果見表1。

表1 菌株CQWU 201410對棘腹蛙的致病性（死亡數(shù)/試驗數(shù)）

2.3 生理生化特性鑒定結(jié)果對菌株CQWU201410進(jìn)行生理生化特性檢測，發(fā)現(xiàn)該菌能利用賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶和DNA酶，在無鹽胨水和6% NaCl胨水中均能生長，不發(fā)酵乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、棉子糖和木糖等，見表2。

2.4 16S rDNA序列分析結(jié)果成功擴(kuò)增到菌株CQWU201410的部分16S rDNA基因序列，長度為1 402 bp。將該序列提交至NCBI進(jìn)行Blast比對，發(fā)現(xiàn)與金黃桿菌親緣關(guān)系最為接近，相似性達(dá)99.0%。結(jié)合比對結(jié)果調(diào)出與候選菌株序列相關(guān)性較高的核酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

2.5 耐藥性試驗結(jié)果菌株CQWU201410對哌拉西林、環(huán)丙沙星等2種抗生素表現(xiàn)出較為明顯的敏感性，對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、頭孢他啶、替卡西林、復(fù)方新諾明等6種抗生素耐藥。見表3。

表2 候選菌株的生理生化特性鑒定

圖1 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 菌株CQWU201410的藥敏試驗

3 結(jié)論與討論

金黃桿菌（Chryseobacterium）是常見條件致病菌［6］，廣泛存在于自然界中。目前國內(nèi)對于金黃桿菌屬細(xì)菌的研究，主要集中在腦膜膿毒金黃桿菌感染人體的臨床治療等方面［7］，而感染水生生物的報道較少。王繼元［8］等在無指盤臭蛙（Odor?rana grahami）皮膚表面分離到一株具有胞外蛋白水解酶活性的菌株，鑒定為金黃桿菌屬中的一個未定種。Zamora［9］等從虹鱒腮部分離到一種具有過氧化氫酶和氧化酶活性的金黃桿菌，該分離株的16S rRNA基因序列與本實驗室分離的候選菌株CQWU201410同源性高達(dá)99.0%，進(jìn)一步證實了金黃桿菌對水生動物的感染性。

本試驗中所鑒定的金黃桿菌是首次從棘腹蛙體內(nèi)分離證實；棘腹蛙感染該菌后病死率高，發(fā)病初期棘腹蛙行動遲緩、停止進(jìn)食，隨后發(fā)生的肝壞死、主要消化器官的出血、壞死導(dǎo)致了較高的死亡率。在分離培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，該菌在28℃下生長速度較快，菌絲蔓延程度大，不利于細(xì)菌形態(tài)的觀察；因此，培養(yǎng)該菌時不宜置于28℃時間過長，8 h后就可從培養(yǎng)箱中取出，在20℃下待其緩慢生長可獲得較佳單個菌落。

本研究選取8種抗生素進(jìn)行了藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)菌株CQWU201410對哌拉西林、環(huán)丙沙星等2種藥物敏感，對慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素等氨基糖苷類抗生素耐藥明顯，對頭孢他啶、替卡西林、復(fù)方新諾明也有較高耐藥性。有報道稱［10-11］金黃桿菌對多種抗菌藥物如氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類［12］、四環(huán)素類、氯霉素天然耐藥，對復(fù)方新諾明、妥布霉素、利福平等復(fù)合抗菌藥物也有較高的耐藥性，與本研究結(jié)果一致。由于該菌對大多數(shù)常用抗菌藥物具有耐藥性，給治療該菌引起的感染帶來很大困難。在臨床防治上應(yīng)特別注意針對該菌的耐藥性分析，以便選用合適的藥物進(jìn)行治療。

［1］李益得，廖長樂，毛壽林，等.我國珍惜兩棲動物-棘腹蛙［J］.經(jīng)濟(jì)動物學(xué)報，2012，16（2）：119-122.

［2］費(fèi)梁，葉昌媛，黃永昭，等.中國兩棲動物檢索及圖解［M］.成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，2005：137-139.

［3］趙爾宓.中國瀕危動物紅皮書：兩棲類和爬行類［M］.北京：科學(xué)出版社，1998：80-83.

［4］譚瑤，趙清，舒為群，等.K-B紙片擴(kuò)散法藥敏試驗［J］.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2010，7（20）：2290-2291.

［5］鄒玉霞，張培軍，莫照蘭，等.大菱鲆出血癥病原菌的分離和鑒定［J］.高技術(shù)通訊，2004，14（4）：89-93.

［6］Holt JG，Krieg N R，Sneath pH A，et al.Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology［M］.Ninth Edition.London：Baitimore，Williams and Wilkins，1994：178：204-225.

［7］陳曉蓓.醫(yī)院金黃桿菌屬分布變遷與耐藥性研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（4）：772-774.

［8］吳泉，沈翠芬，張曉祥，等.黃桿菌屬細(xì)菌的分離與藥敏分析［J］.江西醫(yī)學(xué)檢驗，2006，24（5）：471.

［9］Kirby JT，Sader H S，Walsh TR，etal.Antimicrobial susceptibil?ity and epidemiology of a worldwide collection of Chryseobacteri?um spp：report from the SENTRY antimicrobial surveillance pro?gram［J］.JClin Microbiol，2004，42（1）：445.

［10］董蘅，賀鳳鳳，王名貴.黃桿菌屬細(xì)菌感染52例抗菌治療分析［J］.中國實用內(nèi)科雜志，1999，19（7）：435-436.

［11］Bellais S，Poirel L，Leotard S，et al.Genetic diversity of car?barpennem-hydrolyzingmetallo-β-lactamase from Chryseobacte?rium（Flavobacterium）indologenes［J］.Antimicrob Agents Ch，2000，44（11）：3028-3034.

［12］林永恩.腦膜膿毒金黃桿菌研究進(jìn)展［J］.內(nèi)科，2010，5（4）：408-410.

S852.61+8

B

0529-6005（2015）12-0097-03

2015-03-04

重慶市科技計劃項目（cstc2014jcyjA80042）；重慶市科技攻關(guān)計劃（cstc2012gg-yyjs80004）；重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目（KJ1401105）；重慶文理學(xué)院人才引進(jìn)項目（R2013LS13）

吳寶紅（1994-），女，本科生，學(xué)習(xí)方向為生物技術(shù)（檢驗檢疫），E-mail：309289786@qq.com

樊汶樵，E-mail：wonderbreeze@126.com