傅光華，危斌勇，陳翠騰，傅秋玲，潘飛龍，程龍飛，陳紅梅，萬春和，施少華，黃 瑜

（1.福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州350013；2.江西省南城縣畜牧水產(chǎn)局，江西南城344700）

入孵種鴨胚病毒性感染的檢測及禽坦布蘇病毒的分離鑒定

傅光華1，危斌勇2，陳翠騰1，傅秋玲1，潘飛龍2，程龍飛1，陳紅梅1，萬春和1，施少華1，黃 瑜1

（1.福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州350013；2.江西省南城縣畜牧水產(chǎn)局，江西南城344700）

本研究應用RT-PCR技術對孵化過程中死亡的不同品種種鴨胚進行常見病毒感染檢測。結(jié)果表明，死亡的種鴨胚感染病毒種類多達9種，且首次從鴨胚中檢測到禽坦布蘇病毒（ATV）感染，不同品種的種鴨胚病毒感染率差異較大，以種番鴨胚感染率最高達58.82%。ATV囊膜蛋白（E）基因分析表明，3株種鴨胚ATV分離毒（PT15-4株、FJFQLL36株和PT15-27株）與GenBank中已發(fā)布鴨源ATV囊膜蛋白的核苷酸及氨基酸序列同源性分別在97.2%～99.8%及97.1%～99.4%之間，親緣關系密切。動物試驗表明，3株病毒對開產(chǎn)麻鴨的致病性不盡相同，其中PT15-4株和PT15-27株可引起麻鴨產(chǎn)蛋量顯著降低及卵巢的出血病變，而FJFQLL36株病毒對麻鴨產(chǎn)蛋影響不明顯，且未引起蛋鴨卵巢明顯出血或卵黃液化病變。以上結(jié)果表明，我國種鴨胚中病毒性感染較為復雜，而且還出現(xiàn)了ATV的感染，盡管不同禽坦布蘇病毒分離株間存在毒力差異，但均可從種鴨經(jīng)卵傳播到種蛋而成為新的傳染源。

入孵種鴨胚；病毒性胚胎??；禽坦布蘇病毒；垂直傳播

我國為世界水禽生產(chǎn)大國，其飼養(yǎng)量占全球總量的75%以上，但并非水禽生產(chǎn)強國，其種鴨場養(yǎng)殖水平、孵化場建設和種蛋孵化水平等均參差不齊，尤其是近些年來孵化場入孵種鴨胚出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象有所增多。我們自2011年以來，從福建、江西、廣東、廣西等?。▍^(qū)）部分種鴨孵化場收集的入孵后不同時候死亡受精種鴨胚，通過照胚剔除蛋內(nèi)發(fā)黑鴨胚，取尿囊液清亮的死亡種蛋胚內(nèi)容物分別進行了鴨常見病毒的檢測，發(fā)現(xiàn)受檢的五種不同品種種鴨胚其病毒感染的陽性率、感染的病毒譜存在較大差異，其中坦布蘇病毒感染在5種不同種鴨胚中均存在。對以鴨胚成纖維細胞分離純化后鑒定的3株種鴨胚源禽坦布蘇病毒進行結(jié)構(gòu)蛋白基因特性和致病性測定，表現(xiàn)出不同的致病性，這提示感染過禽坦布蘇病毒的種鴨很可能以垂直傳播方式將該病毒傳至種蛋中成為新的傳染源。現(xiàn)將相關研究及其結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品的來源及處理自福建、江西、廣東、廣西等?。▍^(qū)）部分種鴨孵化場收集入孵后不同時候死亡的受精種鴨胚781枚，通過照胚剔除蛋內(nèi)發(fā)黑鴨胚后最終獲得476枚死亡種蛋胚，其中北京鴨種鴨胚109枚、北京櫻桃谷種鴨胚163枚、白改鴨種鴨胚73枚、種麻鴨胚80枚、種番鴨胚51枚。用3%碘酊及75%酒精對種鴨胚蛋外殼進行消毒，無菌死亡種蛋胚內(nèi)容物用于病毒的檢測，采集的樣品于-80℃條件下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和試驗動物AMV反轉(zhuǎn)錄酶和RNase Inhibitor，購自Thermo生物科技有限公司；DNA/ RNA抽提試劑盒、DNA瓊脂膠回收試劑盒，購自QIAGEN科技有限公司；DNA聚合酶和pMD18-T載體，購自寶生物工程（大連）有限公司。160日齡產(chǎn)蛋麻鴨，購自福州某蛋鴨養(yǎng)殖場，經(jīng)檢測禽坦布蘇病毒血清抗體為陰性。

1.3 病毒感染的檢測取適量種鴨胚內(nèi)容物與2倍體積無菌PBS（pH值7.2）勻漿后凍融3次，離心取上清以DNA/RNA提取試劑盒提取總的核酸，參照已報道的鴨常見病毒檢測方法（如禽流感病毒［1］、鴨甲肝病毒、細小病毒、新城疫病毒［2］、鴨坦布蘇病毒［3］、鴨呼腸孤病毒［4］、鴨瘟病毒［5］、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒和圓環(huán)病毒等9種病毒）進行檢測。

1.4 禽坦布蘇病毒的分離及E蛋白基因序列測定隨機取6份檢測為禽坦布蘇病毒單一陽性的樣品，反復凍融3次后，于4℃下經(jīng)8 000 r/min離心30min，取上清接種鴨胚成纖維細胞，觀察細胞病變、收集細胞毒，并提取其總RNA，參照［6］報道的方法擴增病毒E蛋白編碼基因，送上海生工生物工程技術服務有限公司測定。應用LASER?GENE.7.0等分子生物學軟件將獲得E基因測序結(jié)果進行序列編輯、同源性比對及分子系統(tǒng)進化等分析。

1.5 禽坦布蘇病毒對產(chǎn)蛋麻鴨致病性測定自福建省山區(qū)購進141日齡麻鴨400只，分欄隔離飼養(yǎng)。以自死亡種鴨胚中分離的3株禽坦布蘇病毒細胞傳代毒分別經(jīng)腿部肌肉注射160日齡產(chǎn)蛋麻鴨（產(chǎn)蛋率約63%）各50只（即通過摸蛋隨機選取已開產(chǎn)蛋鴨31只、未開產(chǎn)19只）、1mL/只，設為A、B組和C組；經(jīng)肌肉注射1 mL/只無菌生理鹽水的50只（同前選鴨）麻鴨為注射應激對照組（D組），另留50只（同前選鴨）麻鴨作為無注射應激的空白對照組（E組）。將5組試驗蛋鴨隔離飼養(yǎng)，每天觀察2次、連續(xù)觀察14 d，及時記錄其采食量及產(chǎn)蛋情況等臨床表現(xiàn)，于攻毒后第7天每組撲殺3只蛋鴨以觀察卵巢病變。

2 結(jié)果

2.1 死亡種胚蛋中病毒的檢測結(jié)果運用RTPCR方法，對采集的476份死亡種蛋胚內(nèi)容物分別進行以上9種病毒的檢測。結(jié)果顯示，這些死亡的種鴨胚病毒感染陽性率為25.63%。檢測的9種病毒中，以禽坦布蘇病毒的感染陽性率最高，為6.51%，禽流感病毒、禽坦布蘇病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒和鴨圓環(huán)病毒等4種病毒在5種種鴨胚中均檢測到，而鴨瘟病毒在5種種鴨胚均未檢測到。各種種鴨胚的病毒感染陽性率也各不相同，其中種番鴨胚病毒感染陽性率最高（58.82%），而北京種鴨胚病毒陽性率最低，為15.59%。各品種種鴨胚的病毒感染種類和數(shù)量的檢測情況見表1。

2.2 種鴨胚源禽坦布蘇病毒的分離、純化與鑒定隨機取6份檢測為禽坦布蘇病毒單一陽性的死亡種鴨胚樣品，經(jīng)常規(guī)處理后取上清接種鴨胚成纖維細胞，連傳3代后分離到5株病毒，隨機取其中3株病毒（PT15-27、PT15-4、FJFQLL36）進行蝕斑純化，至第8代細胞毒時3株病毒的TCID50分別為102.86/0.1 mL、103.2/0.1 mL、103.75/0.1 mL，經(jīng)特異性RT-PCR鑒定均為禽坦布蘇病毒。

2.3 種鴨胚源禽坦布蘇病毒E蛋白基因的序列分析對以鴨胚成纖維細胞分離、純化的3株病毒（PT15-4、PT15-27和FJFQLL36）參照［7］報道的方法成功獲得了E蛋白編碼基因，測序結(jié)果經(jīng)編輯、拼接后進行同源性及分子遺傳進化分析。結(jié)果表明，3株病毒的E蛋白編碼基因與GenBank中近來從家禽中分離的坦布蘇病毒的核苷酸序同源性在97.2%～99.8%之間，氨基酸序列同源性在97.1%～99.4%之間，而與2010年以前的分離毒株Sitiawan病毒核苷酸和氨基酸序列同源性較低。基于E蛋白編碼基因序列的系統(tǒng)進化分析表明，本研究分離的3株坦布蘇病毒與2010年后分離的不同禽源坦布蘇病毒分離株處于同一個大的進化分支中，而MM1775株（蚊蟲源）和Sitiawan株（肉雞源）則構(gòu)成另外一個進化分支（見圖1）。

表1 不同品種種鴨胚蛋中9種病毒感染的檢測結(jié)果

圖1 3株種鴨蛋源禽坦布蘇病毒分離株系統(tǒng)進化分析

2.4 種鴨胚源禽坦布蘇病毒致病性本次蛋鴨試驗注射應激對蛋鴨產(chǎn)蛋率的影響為3.1%（見表2），以分離純化的3株病毒（PT15-4、PT15-27和FJFQLL36）第8代細胞毒分別感染160 d產(chǎn)蛋麻鴨的A、B、C組中，在觀察的14 d內(nèi)A、B兩組蛋鴨的產(chǎn)蛋率與攻毒前相比分別降低45.9%和47.1%，與空白對照E組的產(chǎn)蛋率相比分別降低42.6%和43.8%；C組蛋鴨的產(chǎn)蛋率與攻毒前相比降低12.1%，比空白對照E組的產(chǎn)蛋率降低8.8%（見表2）。于攻毒后第7天，分別從5組蛋鴨中隨機撲殺3只觀察卵巢（卵泡）病變，結(jié)果只有A、B兩組蛋鴨卵泡表現(xiàn)明顯出血、大部分卵泡卵黃液化。

表2 3株病毒試驗感染開產(chǎn)麻鴨產(chǎn)蛋情況（枚）

3 討論

本研究對2011年以來采集的死亡種鴨胚進行病毒感染檢測發(fā)現(xiàn)，病毒感染陽性率達到25.63%，其中禽流感病毒、禽坦布蘇病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒和鴨圓環(huán)病毒等四種病毒在5種種鴨胚中均有不同程度的感染，感染的陽性率最低的為1.23%、高者達16.25%。有的種鴨胚甚至檢測到8種病毒。各種種鴨胚中，以種番鴨胚病毒感染陽性率最高，為58.82%?？梢?，我國福建、江西、廣東、廣西等?。▍^(qū)）部分孵化場入孵后死亡的種鴨胚中病毒感染即病毒性胚胎病較為普遍和嚴重。

禽坦布蘇病毒是2010年4月在我國家禽，尤其是種（蛋）鴨中出現(xiàn)的新發(fā)病毒，主要引起種（蛋）禽產(chǎn)蛋驟降［3、7-8］。有學者從發(fā)生禽坦布蘇病毒病鴨場收集的蚊子中分離到該病毒［9］，推測蚊蟲在該病毒的傳播中很可能發(fā)揮重要作用。然而，值得注意的是，在冬春蚊子較少的季節(jié)，該病仍在北方飼養(yǎng)的種（蛋）鴨群持續(xù)流行［8］，可見該病毒除了蚊蟲外還可通過其他的方式在家禽中散播，其傳播方式極為復雜。王英等［10］發(fā)現(xiàn)1日齡雛鴨也可檢測到攜帶禽坦布蘇病毒，且同場其他日齡的肉鴨都有該病毒感染的現(xiàn)象，據(jù)此推測禽坦布蘇病毒存在垂直傳播的可能。趙冬敏等［11］從發(fā)病母鵝到雛鵝出生的整個過程中均檢測到坦布蘇病毒感染，由此推斷禽坦布蘇病毒可經(jīng)鵝胚傳到下一代。本研究也從入孵后死亡的種鴨胚中檢測到禽坦布蘇病毒，且種鴨胚感染率很高。盡管麻鴨攻毒試驗表明，種鴨胚分離獲得的禽坦布蘇病毒的毒力存在株間差異，但這些毒株與已報道的鴨源分離株基因序列同源性很高，親緣關系密切。種鴨胚中的禽坦布蘇病毒很可能是由種鴨經(jīng)卵傳播到種蛋而來，這與趙冬敏等報道禽坦布蘇病毒可經(jīng)鵝胚傳到下一代的結(jié)論相同。因此，對曾感染過禽坦布蘇病毒的種（蛋）禽群所產(chǎn)種蛋，應高度重視禽坦布蘇病毒感染的監(jiān)測。

［1］農(nóng)業(yè)部，高致病性禽流感防治技術規(guī)范-2007716151735［S］. 2007.

［2］GBT 16550-2008，新城疫診斷技術［S］.2008.

［3］萬春和，施少華，黃瑜，等.一種引起種（蛋）鴨產(chǎn)蛋驟降新病毒的分離與初步鑒定［J］.福建農(nóng)業(yè)學報，2010，25（6）：663-666.

［4］許秀梅，蘇敬良，黃瑜，等.兩株鴨源禽呼腸孤病毒S3基因序列分析［J］.中國獸醫(yī)雜志，2008，44（1）：12-14.

［5］Plummer pJ，Alefantis T，Kaplan S，et al.Detection of duck en?teritis virus by polymerase chain reaction［J］.Avian Disease，1998，42（3）：554-564.

［6］傅光華，陳紅梅，黃瑜，等.白羽半番肉鴨坦布蘇病毒的分離鑒定及結(jié)構(gòu)蛋白基因分析［J］.福建農(nóng)業(yè)學報，2012，27（10）：1027-1031.

［7］曹貞貞，張存，黃瑜，等.鴨出血性卵巢炎的初步研究［J］.中國獸醫(yī)雜志，2010，46（12）：3-6.

［8］Su J，Li S，Hu X，et al.Duck Egg-DropSyndrome Caused by BYD Virus，a New Tembusu-related Flavivirus［J］.PLoS One，2011，6（3）：e18106.

［9］Liu P，Lu H，Li S，et al.Genomic and antigenic characterization of the newly emerging Chinese duck egg-dropsyndrome flavivi?rus：genomic comparison with Tembusu and Sitiawan viruses［J］.J G Virol，2012，93：2158-2170.

［10］王英，馮艷杰，于建霞，等.警惕鴨黃病毒的垂直傳播［C］.中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十六次學術研討會，北京：2012.

［11］趙冬敏，黃欣梅，劉宇卓，等.新型黃病毒在種鵝中垂直傳播的研究［J］.南方農(nóng)業(yè)學報，2012，43（1）：99-102.

Investigation of viral infection and isolation and identification of avian Tembusu virus in hatching-egg from breeding duck

FU Guang-hua1，WEIBin-yong2，CHEN Cui-teng1，F(xiàn)U Qiu-ling1，PAN Fei-long2，CHENG Long-fei1，CHEN Hong-mei1，WAN Chun-he1，SHIShao-hua1，HUANG Yu1
（1.Institute of AnimalHusbandry and Veterinary Medicine of Fujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou 350012，China；2.Animal Husbandry and Fishery Bureau of Nancheng County，Nancheng 344700，China）

We investigated the viral infection in dead hatching-egg of duck using reverse-transcriptase polymerase chain action（RT-PCR）.The results showed thatat leastnine avian viruseswere found in the dead duck embryos，ofwhich avian tembusu virus（ATV）was also detected.The positive rates of viral infection among eggs-specieswere different，and the highest ratewas in hatching-eggs from breeding Muscovy duck（58.82%）.Sequence analysis of envelope gene of three ATV isolates（PT15-4，F(xiàn)JFQLL36 and PT15-27）showed that these viruses shared a high homology of 97.2%to 99.8%and 97.1%to 99.4%with duck-origin ATV in the nucleotide acid and deduced amino acid sequence，respectively.Animal experiment showed that virus strain PT15-4 and PT15-27 could cause severe eggproduction dropand severe pathology in laying duck，while virus strain FJFQLL36 could not cause death and affect the performance of laying ducks.The fact of the ATV-infection in hatching-eggs indicated that the ATV in infected duck m ight have the ability of transovarian transmission andmake the fertile eggs to be a newly virus carrier.

hatching-eggs from breeding duck；viral infection in embryos；avian tembusu virus；transovarian transm ission Corresponding author：HUANG Yu

S834

A

0529-6005（2015）12-0089-03

2015-08-11

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助（CARS-43）；國家自然科學基金項目（31201936）；福建省優(yōu)良蛋鴨品種與設施化養(yǎng)殖創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)化工程項目；福建省農(nóng)業(yè)科學院“雙百”行動項目（sbmx1507-3；sbmx1507-2）

傅光華（1977-），男，博士，副研究員，主要從事禽病分子病毒學研究，E-mail：fuyuan163@163.com

黃瑜，E-mail：huangyu_815@163.com