胡曉苗，戴 銀，沈?qū)W懷，趙瑞宏，侯宏艷，潘孝成，周學(xué)利，張丹俊，朱傳明

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥230031）

鵝源鴨疫里默菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

胡曉苗，戴 銀，沈?qū)W懷，趙瑞宏，侯宏艷，潘孝成，周學(xué)利，張丹俊，朱傳明

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥230031）

鵝傳染性漿膜炎是由鴨疫里默菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起鵝的以纖維蛋白滲出并在臟器表面沉積，胸、腹腔大量積液為特征的一種接觸傳染性疾病，其特征是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪型輸卵管炎和腦膜炎。2～8周齡鵝多發(fā)，發(fā)病率90%，死亡率10%～40%，給養(yǎng)鵝業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)有關(guān)鵝傳染性漿膜炎研究比較少，胡清海［1］研究表明，2株鵝源RA分離株對(duì)雛鴨和雛鵝的致病性沒(méi)鴨源分離株強(qiáng)，而且對(duì)雛鵝的致病性比雛鴨強(qiáng)。趙寶華［2］從揚(yáng)州郊區(qū)發(fā)病鵝場(chǎng)分離到1株對(duì)鵝具有很強(qiáng)致病性的鵝源RA。呂敏娜［3］分離鑒定出1株血清1型的RA，序列分析顯示，鵝源分離株與鴨源RA處于同一進(jìn)化支上，與雞源RA進(jìn)化關(guān)系稍遠(yuǎn)，對(duì)鴨和鵝均有高致病性，自家疫苗能夠較好地保護(hù)雛鵝。作者對(duì)來(lái)自安徽省兩家疑似患有RA鵝群的病料，進(jìn)行了細(xì)菌分離、生化試驗(yàn)和PCR方法鑒定，分離鑒定出2例鵝源RA，為該病的診斷和防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源選擇兩家鵝場(chǎng)具有典型纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎以及腸炎的病死鵝，無(wú)菌操作采集患病鵝的肝臟與腦組織。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)無(wú)菌環(huán)境下操作，取病死鵝的肝臟和腦接種在胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA培養(yǎng)基）上，在37℃二氧化碳恒溫箱中培養(yǎng)36 h。若未培養(yǎng)出疑似菌落則重新取樣分離，若存在則挑選平板上數(shù)個(gè)圓形、透明、邊緣光滑、奶油狀的菌落平板劃線法在LB培養(yǎng)基上傳代，于37℃CO2恒溫箱中培養(yǎng)36 h～48 h以獲得純培養(yǎng)。

1.3 革蘭染色取之前純培養(yǎng)的菌做菌液，經(jīng)涂片固定，做革蘭染色。

1.4 生化試驗(yàn)鑒定挑取2組新鮮菌液按常規(guī)方法分別進(jìn)行明膠液化試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)。

1.5 PCR方法的鑒定

1.5.1 PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank中發(fā)表的鴨疫里默菌（RA）1-19型16S rRNA基因序列分別與大腸埃希菌等的16S rRNA基因序列比對(duì)設(shè)計(jì)特異性引物［4］：F：5′-CTGAACACGGTGTACGAATAAG-3′；R：5′-TCTTATACGAGTCCCCAAC-3′，片段大小680 bp。采用20μL體系：RA 16s rRNA F：0.5μL，RA 16 s rRNA R：0.5μL，DNA模板1μL（新鮮菌液），Premix Taq DNA聚合酶10μL，ddH2O補(bǔ)足20μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30 s，58℃復(fù)性45 s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育8 min。凝膠電泳檢測(cè)，取20μL PCR產(chǎn)物混合2μL 10 Loading Buffer在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，另加5μL DL-2 000 DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

1.5.2 PCR產(chǎn)物的純化與克隆PCR產(chǎn)物純化及與質(zhì)粒pMD18-T的連接分別參照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α、篩選陽(yáng)性克?。?］。

1.5.3 重組質(zhì)粒的鑒定將根據(jù)藍(lán)白斑篩選原則篩選的陽(yáng)性克隆接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）中振蕩培養(yǎng)后，取2 mL重組菌液，用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽取試劑盒抽提質(zhì)粒，PCR后拍照鑒定，取經(jīng)鑒定的重組菌液1 mL送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。

1.6 藥敏試驗(yàn)按常規(guī)藥敏紙片法測(cè)定2株分離菌株對(duì)頭孢噻肟、丁胺卡那霉素等18種抗生素的敏感性。敏感度根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)菌落較小，呈圓形、透明、邊緣光滑、奶油狀，取純培養(yǎng)菌做菌液，經(jīng)涂片固定，做革蘭染色，在油鏡下觀察到紅色陰性小桿菌，單個(gè)或成對(duì)，少數(shù)呈絲狀，無(wú)芽孢。

2.2 生化試驗(yàn)鑒定兩株分離菌株不發(fā)酵糖類(lèi)和醇類(lèi)，不產(chǎn)生硫化氫，尿素酶和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性（見(jiàn)表1）。因此，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)和生化特性可初步確定為RA。

2.3 病鵝腦部分離菌株16s rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果病鵝腦部?jī)芍攴蛛x菌株以16s rRNA設(shè)計(jì)引物時(shí)PCR擴(kuò)增得都1條680 bp的特異性條帶（見(jiàn)圖

1），與預(yù)期結(jié)果相符。

表1 鴨疫里默菌分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 目的基因克隆及重組質(zhì)粒鑒定經(jīng)鑒定陽(yáng)性的菌株進(jìn)行增菌培養(yǎng)，用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽取試劑盒抽取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR鑒定，電泳檢測(cè)，結(jié)果與預(yù)期一致（見(jiàn)圖2）。

圖1 PCR檢測(cè)結(jié)果

2.5 序列測(cè)定及分析2株RA重組質(zhì)粒樣品測(cè)序后經(jīng)BLAST進(jìn)行序列分析，測(cè)序結(jié)果與Gen?Bank中收錄的鴨疫里默菌基因序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步證實(shí)為鴨疫里默菌序列。

圖2 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果兩株細(xì)菌（AH1、AH2）藥敏試驗(yàn)結(jié)果為，AH1對(duì)頭孢噻肟鈉、硫酸丁胺卡那霉素高敏；對(duì)阿奇霉素中敏；AH2對(duì)強(qiáng)力霉素、壯觀霉素高敏；對(duì)左氧氟沙星、新霉素中敏；而兩株對(duì)氟苯尼考、慶大霉素、氨芐西林、潔霉素、鏈霉素、阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、磷霉素、環(huán)丙沙星、羅美沙星、利福平等藥物均不敏感。

3 討論

3.1 對(duì)RA感染進(jìn)行準(zhǔn)確診斷必需依靠細(xì)菌的分離和鑒定。鑒定RA通常檢測(cè)其培養(yǎng)特性、染色反應(yīng)、生理生化特征、菌體的某些化學(xué)組成等表型指標(biāo)，但RA常缺乏特定的表型特征和選擇性的培養(yǎng)基［6］，僅依據(jù)表型卻不足以對(duì)RA做出準(zhǔn)確鑒定。因此，使用分子方法進(jìn)行鑒定十分必要。本試驗(yàn)通過(guò)細(xì)菌分離、生理生化鑒定、16S rRNA分析，將生理生化特性測(cè)定與16S rRNA序列分析鑒定相結(jié)合，使鑒定結(jié)果更科學(xué)、更準(zhǔn)確。

3.2 由于細(xì)菌的16S rRNA基因分子結(jié)構(gòu)上的高度保守性，因此常用于對(duì)細(xì)菌的種屬鑒定［7-9］。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)2株鵝源RA安徽流行株的16S rRNA基因擴(kuò)增和序列分析，鑒定其是否屬于鴨疫里默氏菌，所得到的序列通過(guò)比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與GenBank上發(fā)布的RA的16S rRNA的同源性達(dá)到99.98%。

3.3 藥物敏感性試驗(yàn)中，2株鵝源里默菌對(duì)相同藥物的敏感性不盡相同，與其他報(bào)道也不盡相同［10］，說(shuō)明不同鴨群RA的分離株對(duì)同種藥物表現(xiàn)出差異，藥敏試驗(yàn)對(duì)臨床用藥治療RA感染具有重要的意義。目前由于濫用抗菌類(lèi)藥物而導(dǎo)致耐藥性日益嚴(yán)重，因此鵝場(chǎng)感染RA后，最好根據(jù)RA的藥敏試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行治療，避免因藥物耐藥性而造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。

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S852.612

B

0529-6005（2015）12-0048-02

2015-02-12

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-41）；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（11C0404）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31302044）

胡曉苗（1971-），男，助理研究員，碩士，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究，E-mail：huxiaomiao66@163.com

戴銀，E-mail：daiyin2020@163.com