黃淑成，張義博，黃永宣，劉成蔭，郝世秋，劉 偉，仝宗喜

（河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州450002）

熱應激對肉雞血清內毒素含量和肝臟中TLR4 m RNA表達的影響

黃淑成，張義博，黃永宣，劉成蔭，郝世秋，劉 偉，仝宗喜

（河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州450002）

為探討肉雞熱應激條件下血液內毒素對肝臟TLR4mRNA表達的影響，我們復制肉雞熱應激模型。應用鱟試劑法和分子生物學等方法檢測不同熱應激時間段內毒素和TLR4mRNA表達量的變化。試驗結果顯示，與對照組相比，熱應激組肉雞血清內毒素與TLR4mRNA在肝臟中的表達差異均極顯著（P＜0.01）。表明熱應激條件下內毒素含量的升高可以對肉雞肝臟造成損傷。

肉雞；熱應激；內毒素；肝臟；TLR4mRNA

現(xiàn)代過分追求肉雞的高生長率使肉雞對環(huán)境的各種應激源表現(xiàn)出很高的敏感性。尤其對高溫更敏感，特別是高密度飼養(yǎng)的肉雞發(fā)生熱應激更為常見。內毒素（LPS）是革蘭陰性細菌外膜的重要成分，也是引起機體免疫反應的成分之一，正常生理條件下，體內內毒素水平很低，當受到外界刺激、環(huán)境改變時機體的腸道菌群紊亂，引起內毒素移位入血，刺激機體靶細胞產生炎癥反應，嚴重的造成休克、多器官功能衰竭甚至死亡［1］。另外，有研究指出，Toll樣受體4（TLR4）是LPS的受體或信號轉導分子，并在信號轉導中具有重要作用［2］。因此，檢測LPS受體TLR4在肝臟中的表達變化對探討內毒素對肝臟的損傷具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗動物健康的20日齡AA肉雞50只，購自河南開封正大肉雞繁育基地。

1.2 主要試劑細菌內毒素標準品、血液內毒素檢測用1號液體處理劑（批號：1204240），2號液體處理劑（批號：1207090），細菌內毒素檢查用水（批號：1209170），定量檢測用鱟試劑（批號：1210072）：湛江博康海洋生物有限公司；TRIZol液：Amresric公司生產；RT-PCR試劑盒：美國Pro?mega公司生產。

1.3 主要器材BET-32M細菌LPS定量測定儀，天津市天大天發(fā)科技有限公司生產；XK96-4型微量振蕩器，姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司生產；小型臺式高速冷凍離心機，Eppendorf公司生產；Mastercyder EpRealplex型熒光定量PCR儀：Ep?pendorf公司生產。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗分組參照李玉保等［3］肉雞熱應激病例模型復制方法，挑選20日齡AA肉雞50只隨機分成對照組（20只）和熱應激組（30只），在常規(guī)環(huán)境中適應性飼養(yǎng)2周后進行熱應激處理。試驗開始后將熱應激組環(huán)境溫度在20 min內從（22℃± 1℃）升高至（38℃±1℃）。所有應試雞在試驗期間應禁食，自由飲水。

1.4.2 樣品采集與處理在熱應激持續(xù)2、5、10 h時分別對熱應激組和對照組肉雞進行心臟采血各5 mL，取0.5mL移至含有1號處理液的離心管中，采用鱟試劑法檢測血清中內毒素含量。采血后將所有受試雞剖殺，取肝臟組織于液氮中保存待測。

1.4.3 引物設計根據(jù)已經(jīng)發(fā)表雞的TLR4基因的mRNA序列［4］運用Primer Premier 5.0軟件設計兩對引物。TLR4引物序列：上游引物：5′-GAGA?ACCTCAATGCGATGC-3′，下游引物：5′-ATAG?GAACCTCTGACAACG-3′；GAPDH引物序列：上游引物：5′-TGAAAGTCGGAGTCAACGG-3′，下游引物：5′-ACGCTCCTGGAAGATAGTGA-3′。由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成（iPAGE級別）。

1.4.4 RT-PCR方法用TRIZol法對肝臟組織中TLR4總RNA進行提取，最后以cDNA為模板進行PCR擴增，并使用SYBR GreenⅠ對RT-PCT產物進行非特異性標記，并使用2-△△CT方法計算出TLR4mRNA相對定理表達結果。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理試驗涉及的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件的One-Way ANOVA進行方差分析與多重比較，結果以“平均數(shù)±標準誤”表示，并采用GraphPad Prism 5軟件繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結果

2.1 臨床表現(xiàn)熱應激后，對照組肉雞臨床表現(xiàn)無明顯變化。熱應激組肉雞表現(xiàn)為精神沉郁，活動減少，翅膀張開，部分肉雞臥于籠底；呼吸困難，張口呼吸，呼吸頻率加快，出現(xiàn)長時間的熱性喘息，可明顯觀察到胸廓快速和劇烈的收縮與擴張。另外還發(fā)現(xiàn)部分肉雞的糞便稀薄，飲水增加，用喙啄水沾濕羽毛。

2.2 血清內毒素的變化肉雞血清中內毒素水平的變化見圖1。隨熱應激時間的持續(xù)，試驗組肉雞血清中內毒素的含量表現(xiàn)急劇上升的趨勢，熱應激持續(xù)10 h左右時，血清中內毒素的量達到最高點。與對照組肉雞相比，熱應激2 h時試驗組血清中內毒素的含量差異極顯著（P＜0.01）；熱應激5 h和10 h時試驗組血清中內毒素的含量差異均極顯著（P＜0.01）。

圖1 熱應激對肉雞血清中內毒素水平的影響

2.3 TLR4受體mRNA在肝臟中表達的變化

2.3.1 TLR4受體RT-PCR溶解曲線的建立將不同稀釋度的標準品作為模板，用熒光定量PCR儀將GAPDH和TLR4基因的溶解曲線進行檢測。試驗結果表明，GAPDH和TLR4的溶解溫度分別是86.5℃和84.3℃。且GAPDH和TLR4溶解曲線都只有一個波峰，表明RT-PCR在擴增過程中無引物二聚體產生和非特異性產物擴增。

2.3.2 mRNA質量PCR檢測經(jīng)微量紫外分光光度計檢測，所有樣品的OD260/OD280值均在1.8～2.0之間，表明RNA樣品純度較好無蛋白質污染，達到后續(xù)試驗的要求。通過瓊脂糖凝膠電泳顯示，肉雞TLR4 mRNA擴增片段在200～300 bp之間與預期的272 bp相一致。肉雞的內參基因GAPDH擴增片段在100～200 bp之間與預期的156 bp相一致（圖2）。

圖2 熱應激肉雞肝臟TLR 4受體m RNA產物凝膠電泳

2.3.3 TLR4受體mRNA在肝臟中的表達變化肝臟TLR4受體mRNA的相對表達變化見圖3，與對照組肉雞相比，熱應激2、5、10 h時試驗組TLR4 mRNA的表達量均呈差異極顯著（P＜0.01）。同時，熱應激組在熱應激持續(xù)2 h時，TLR4mRNA的表達量是對照組的1.021倍；熱應激持續(xù)5 h時，TLR4 mRNA的表達量是對照組的1.659倍；熱應激持續(xù)10 h時，TLR4 mRNA的表達量是對照組的3.272倍?？梢?，隨著熱應激時間的延長，TLR4mRNA的表達量在迅速上升。

圖3 熒光定量PCR分析TLR4在肝臟中變化

3 討論

3.1 內毒素含量的變化肉雞熱應激后血清中內毒素含量升高，與對照組相比呈差異極顯著（P＜0.01）（圖1）。分析其原因可能是由于腸道的微生態(tài)平衡遭到破壞，引起細菌的大量繁殖與死亡，一方面通過腸道屏障移位的細菌和內毒素可以引起腸黏膜水腫，腸絨毛膜頂部細胞壞死脫落，并激活成纖維細胞產生TNF-α、IL-1等細胞因子破壞腸黏膜的屏障作用［5］；另一方面，腸黏膜缺血缺氧引起腸道產生過量酸性產物，使細胞代謝過程受阻并引發(fā)組織損傷，促使細胞外鈣離子內流而使細胞組織水腫，引起上皮通透性增加。從而加重細菌和內毒素移位入血［6］。高洪等［7］研究發(fā)現(xiàn)，內毒素注入山羊靜脈5 h后，肝臟表現(xiàn)明顯的實質細胞退行性變化，肝小葉壞死，微血管淤血，血管內嗜中性粒細胞和淋巴細胞粘聚等病理變化。這提示內毒素能夠引起肝功能損傷，抑制肝臟的解毒和清除機能。因此，腸道的屏障作用破壞后，大量的內毒素和細菌移位入血，隨血液循環(huán)到達肝臟引起肝細胞的破壞，抑制肝臟的解毒功能，從而導致血液中內毒素含量急劇增加，對機體產生毒性作用。

3.2 TLR4受體mRNA在肝臟中的變化有試驗顯示，使用具有LPS反應缺陷的C3H/HeJ小鼠品系，在Beutler組顯示TLR4是LPS的一個重要傳感器［8］。有學者在小鼠進行的定點克隆研究中表明，LPS位座編碼一種TLR4，該受體作為LPS受體復合物的跨膜成分在轉導脂多糖（LPS）信號時起重要作用［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，TLR4是識別內毒素的主要受體，也是內毒素惟一的跨膜信號受體［9］。由于肝臟是LPS攻擊的第一個靶器官，另外，革蘭陰性菌引起機體損傷主要由LPS介導，所產生LPS首先到達肝臟與肝臟產生的急性期蛋白LBP結合，形成LPS-LBP復合物，再由LBP將LPS轉移到細胞膜表面的CDl4上，在分泌蛋白髓樣細胞分化蛋白-2的作用下與TLR4結合，TLR4形成同源二聚體信號傳導到細胞內，主要通過MyD88-依賴的信號通路最終增強NF-κB抑制蛋白激酶（IκB kinase，IKK）活性，導致了IκB的磷酸化和降解，解除對NF-κB的抑制，NF-κB遂發(fā)生轉位而進入細胞核，指導靶基因的轉錄，表達一系列的細胞因子、趨化因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等。使機體產生系列的免疫應答［10-11］，最終引起肝細胞的損傷。

熱應激刺激時，血清中內毒素含量急劇升高，大量的內毒素進入肝組織中，激活其特異性受體TLR4，使TLR4在肝臟中的表達量升高（圖3），高表達的TLR4能使內毒素分子有足夠的跨膜受體延續(xù)信號傳導，擴大內毒素的各種生物學效應，對肝臟組織造成損傷。本試驗研究結果顯示，試驗組肝臟TLR4mRNA表達量急速升高，在熱應激10 h時達到最高值，是對照組TLR4 mRNA的3.272倍。表明LPS刺激肝臟TLR4mRNA的大量表達。LPS再激活TLR4下游信號途徑，使NF-κB激活進入細胞核，指導靶基因的轉錄，表達TNF-α，IL-6等炎癥因子，加劇肝臟組織炎癥細胞浸潤并使肝細胞變性、壞死。

可見，熱應激對肉雞機體的各種損傷過程中，內毒素起到了非常重要的作用，甚至造成肉雞死亡。在肉雞熱應激治療過程中，應考慮清除腸道細菌，降低機體中內毒素的危害作用，建立“菌毒并治”理念。

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Effects of heatstress on serum endotoxin content and the expression of Hepatic TLR4m RNA of Broilers

HUANG Shu-cheng，ZHANG Yi-bo，HUANG Yong-xuan，LIU Cheng-yin，HAO Shi-qiu，LIUWei，TONG Zong-xi
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）

To investigate endotoxin-induced changes in hepatic TLR4 receptor mRNA expression in broilers under heat stress，wemade animalmodel of heat stress.The variation of endotoxin content in serum was detected by Limulus reagent test and the endotoxin-specific receptor TLR4 in liver was detected by molecular biologymethods during heat stress.The results showed that the contents of endotoxin in serum and the activity of TLR4mRNA were significantly elevated（P＜0.01）in the testgroupcom?pared with the control group.Our data indicate that heat stress may cause higher purity of endotoxin and hepatic impairment in broilers.

broilers；heat stress；endotoxin；hepatic；TLR4 Cor responding author：TONG Zong-xi

S858.31

A

0529-6005（2015）12-0027-03

2014-10-10

黃淑成（1988-），男，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物營養(yǎng)代謝病及中毒病研究，E-mail：121147067@qq.com

仝宗喜，E-mail：tongzx0329@sohu.com