吳 瓊， 朱 亮

(大連醫(yī)科大學(xué) 生理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

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蟾蜍坐骨神經(jīng)干雙相動作電位產(chǎn)生機制的探討

吳 瓊， 朱 亮

(大連醫(yī)科大學(xué) 生理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

通過在蟾蜍坐骨神經(jīng)干外表面放置2個引導(dǎo)電極，給予最大刺激引發(fā)動作電位(Action Potential, AP)產(chǎn)生，AP產(chǎn)生后經(jīng)神經(jīng)干傳導(dǎo)而先后通過2個引導(dǎo)電極，記錄坐骨神經(jīng)干雙相動作電位(Biphasic Action Potential, BAP)。然后不斷增大2個外置引導(dǎo)電極之間的距離，分別記錄BAP，觀察BAP波形的改變。結(jié)果表明：BAP的前相總是高于后相；隨電極距離的增大，引導(dǎo)出的BAP前相與后相之間出現(xiàn)切跡，且切跡隨電極距離的增大逐漸明顯。提示膜電位的空間和時間時效性決定了距離變化引起的BAP的不同波形，并闡述了BAP變化產(chǎn)生的機制，加深對神經(jīng)生物電活動的理解。

雙相動作電位； 坐骨神經(jīng)干； 電生理

0 引 言

生物電現(xiàn)象中動作電位的產(chǎn)生機制一直是生理學(xué)教學(xué)中的難點。生理學(xué)實驗是生理教學(xué)的重要組成部分[1]，蟾蜍神經(jīng)干動作電位的引導(dǎo)是機能實驗學(xué)中比較經(jīng)典的一個[2]。蟾蜍坐骨神經(jīng)干動作電位的引導(dǎo)實驗可以通過不同條件下對比細胞內(nèi)記錄和細胞外記錄，加深學(xué)生對動作電位產(chǎn)生機制及其傳播特點的理解，深入了解生物電現(xiàn)象[3-4]。實驗中采用細胞外放置電極的方法[5]，在神經(jīng)干一端給予一個足夠大的電刺激，引發(fā)細胞膜上動作電位的產(chǎn)生。動作電位向神經(jīng)干兩端傳導(dǎo)，先后經(jīng)過2個放置在神經(jīng)干表面的引導(dǎo)電極，兩電極之間連接的示波器記錄到2個相反方向的電位偏轉(zhuǎn)波形，稱為雙相動作電位(Biphasic Action Potential, BAP)。但目前對BAP[6]產(chǎn)生和波形變化的解釋各有不同[7]，對此本實驗予以驗證。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑和實驗動物

SBR-1型雙線示波器(汕頭超聲電子儀器廠)；FZG- 1A 型直流前置放大器(南京電生理儀器廠)；神經(jīng)標本盒；BL-420生物實驗系統(tǒng)。試劑：任氏液(SOP標準)。實驗動物：清潔健康蟾蜍，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 蟾蜍坐骨神經(jīng)標本的制備

按照鄒原等[8]介紹方法制備蟾蜍坐骨神經(jīng)標本。神經(jīng)干應(yīng)盡可能分離得長(上起脊椎處的主干，下沿腓總神經(jīng)與脛神經(jīng)一直分離至踝關(guān)節(jié))，腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)保留其一。在制備標本過程中應(yīng)盡量減少神經(jīng)損傷，確保神經(jīng)標本的興奮性。將分離好的標本放置任氏液中靜置3～5 min后使用。

1.2.2 實驗過程

將神經(jīng)標本盒與刺激電極、引導(dǎo)電極及地線連接。將坐骨神經(jīng)干標本放置在神經(jīng)標本盒內(nèi)，標本脊柱段(粗端)放置在刺激電極端(見圖1)。

S1S2為一對刺激電極，L1L2為一對引導(dǎo)電極，S與L之間標記為地線

圖1 連接示意圖

選擇最大刺激進行實驗，最大刺激為高于使全部神經(jīng)纖維均發(fā)生興奮的刺激強度的刺激。本實驗刺激強度、刺激頻率等刺激參數(shù)均固定，以排除刺激強度增加使動作電位幅度增加所產(chǎn)生的影響[9]；在實驗中兩刺激電極S1S1之間的距離不變以排除刺激電極對實驗結(jié)果的影響[10]。調(diào)節(jié)兩引導(dǎo)電極L1L2之間的距離，引導(dǎo)雙相動作電位波。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用x2±s表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 統(tǒng)計軟件。單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05 表示差異有顯著性。

2 結(jié) 果

(1) 在刺激電極處給予最大刺激(最大刺激為大于使全部神經(jīng)纖維均發(fā)生興奮的刺激強度的刺激，以排除動作電位波形改變產(chǎn)生的影響)后，可引導(dǎo)出BAP(見圖2(a))。調(diào)整波形，使前相波向上，后相波向下。隨著L1和L2兩個引導(dǎo)電極之間距離的增加，前相波與后相波之間出現(xiàn)切跡(見圖2(c))；L1L2之間距離的增大，切跡逐漸明顯(見圖2(c),(d),(e))。

(2) 刺激強度不變，L1L2間的距離改變，BAP幅度發(fā)生變化。距離增加，BAP的幅度增大(見圖3)。

(3) L1L2的距離不變，刺激強度不變，將神經(jīng)干粗的一端放置在刺激電極處產(chǎn)生的動作電位前相幅度高于將神經(jīng)干細的一端放置在刺激電極處產(chǎn)生的動作電位的前相。但無論是粗的一端還是細端放置在刺激電極處，產(chǎn)生的雙相動作電位的前相總是高于后相。

圖2 引導(dǎo)電極之間的距離和雙相動作電位的切跡

(圖(a)～(e)中L1L2距離分別為3.2, 4.2, 5.2, 6.2和7.2 cm)

3 討 論

從圖2可以看出，當兩電極之間距離為3.2 cm時，雙相動作電位的兩個波之間無切跡(圖2(a))。隨著兩電極之間距離的增加，切跡出現(xiàn)且隨著距離增加更加明顯。隨著L1L2距離的改變，BAP產(chǎn)生的機制有著不同的解釋[11]。

我們認為，當切跡未出現(xiàn)時(圖2(a),(b))，BAP的產(chǎn)生機制如圖3[12-13]所示。圖中，A：L1和L2兩點的細胞膜均處于靜息水平，均為內(nèi)負外正。此時L1L2兩點的細胞膜之間無電位差，無BAP波出現(xiàn)。B：神經(jīng)細胞的去極化傳導(dǎo)至引導(dǎo)電極L1處，L1處膜電位翻轉(zhuǎn)成內(nèi)正外負；但此時L2細胞膜尚處在靜息水平， L1和L2之間出現(xiàn)電位差(如B右側(cè)曲線所示)。C：隨著動作電位的傳導(dǎo)，L1和L2所在細胞膜均發(fā)生去極化，L1和L2之間的電位差消失，兩點之間的電位差回到零電位水平。D：L1處細胞膜復(fù)極化但L2處仍處于去極化水平，此時兩點間電位差再次出現(xiàn)，但方向與L1去極化而L2尚未去極化時(B)方向相反。E：動作電位傳向遠端，L1和L2均處在復(fù)極化后的靜息水平，此時兩點間電位差再次消失，曲線回到零電位水平。

圖3 引導(dǎo)電極之間的距離和雙相動作電位的幅度

(圖(a)～(b)的刺激強度一致，L1L2間距離分別為3.01, 6.99, 8.20, 7.61，對應(yīng)的BAP幅度為：(a) 3.01/-2.05 mV; (b) 6.99/-6.13 mV; (c) 8.20/-4.95 mV; (d) 7.61/-4.53 mV)

表1 BAP幅度隨L1L2之間距離的改變

圖3 正常的BAP產(chǎn)生機制示意圖

(左圖A, B, C, D和E均為神經(jīng)干及受到電刺激后細胞內(nèi)外電荷變化的示意圖，右圖為BAP波示意圖)

當切跡出現(xiàn)時(圖2(c),(d),(e))，BAP的產(chǎn)生機制則有所不同，如圖4所示。圖中，L1和L2是放置在神經(jīng)干表面的兩個引導(dǎo)電極。F：L1和L2均處于靜息水平，此時動作電位尚未傳到L1處的細胞膜，則距離刺激電極更遠的L2也處在內(nèi)負外正的靜息水平，無BAP波出現(xiàn)。G：神經(jīng)細胞的去極化傳導(dǎo)至L1處，膜電位翻轉(zhuǎn)成內(nèi)正外負；但此時L2尚處在靜息水平， L1和L2之間出現(xiàn)電位差(如G右側(cè)曲線所示)。到此，曲線上升支的出現(xiàn)與前一種解釋一致。H：動作電位剛剛傳出L1，L1處恢復(fù)到靜息水平，出現(xiàn)曲線的下降支。I：動作電位傳導(dǎo)至L1與L2的中間處細胞膜，此時L1去極化完畢處于復(fù)極化的水平，而L2處的細胞膜還處在靜息水平，L1和L2兩點之間的電位差消失，曲線回到零電位水平。由此才會有前相波后的切跡出現(xiàn)，且兩引導(dǎo)電極之間的距離越遠，動作電位在兩引導(dǎo)電極之間的傳導(dǎo)費時越久[14]，切跡也就越明顯，圖2中我們的實驗結(jié)果也證明了這一點，L1L2距離分別為5.2, 6.2和7.2 cm時，隨著距離的增加，切跡在變長。

圖4 BAP產(chǎn)生切跡的機制示意圖

(左圖F, G, H, I, J和K均為神經(jīng)干及受到電刺激后細胞內(nèi)外電荷變化的示意圖，右圖為BAP波示意圖)

J：隨著動作電位的傳導(dǎo)，L2產(chǎn)生去極化，與處在已經(jīng)復(fù)極化完畢的L1相比，此時兩點間電位差再次出現(xiàn)，但方向與L1去極化而L2尚未去極化時方向相反(G)。K：動作電位傳向遠端，L1和L2均處于復(fù)極化水平，此時兩點間電位差再次消失，曲線回到零電位水平。

通過以上實驗，觀察到雙相復(fù)合動作電位產(chǎn)生的原理，由于兩個引導(dǎo)電極之間的距離不同可以有兩種實驗結(jié)果，原理也不盡相同(見圖3、4)。對于不同長度的具有不同傳導(dǎo)速度的蟾蜍坐骨神經(jīng)，L1L2要增加多少才是本文闡述的第二種原理(圖4)，還需要進一步的實驗證明[15]。但就本實驗室平時所用蟾蜍坐骨神經(jīng)和神經(jīng)標本盒的長度而言，所引導(dǎo)出BAP的機制均為第一種原理形成的(圖3)。

另一方面，實驗結(jié)果中L1L2之間的距離也能夠影響B(tài)AP波的幅度，有如下說明。實驗中測得的動作電位實際上是組成神經(jīng)干中的每根神經(jīng)纖維興奮后的超射值在神經(jīng)干表面的疊加。即此動作電位是一復(fù)合波，其上升相、下降相及峰值不是相應(yīng)的單一動作電位波形的去極化相、復(fù)極化相及峰電位。在雙極記錄時，測得的波形實際上是兩個記錄電極的電位差。某處膜產(chǎn)生動作電位時，對于膜的周邊的電荷會有影響，這也是動作電位借助局部電流傳導(dǎo)的原因。因此L1L2之間的距離越近，也就意味著L2處的膜受L1處膜的動作電位影響越大。這種影響可能導(dǎo)致差值的變小，如圖5所示。

圖5 L1L2之間的距離越近，彼此的電荷影響也越大

坐骨神經(jīng)干是由不同種類神經(jīng)纖維組成，故復(fù)合動作電位記錄的是復(fù)合波。在相同的刺激強度下，粗的一端放置在靠近刺激一側(cè)產(chǎn)生的動作電位幅度要高于細的一端放置在刺激電極一側(cè)。這是由于粗的一端神經(jīng)纖維的數(shù)量較多，而在刺激強度足夠大的情況下，較多的神經(jīng)纖維興奮可以記錄到較大的復(fù)合波。但無論是粗的一端還是細端放置在刺激電極處，產(chǎn)生的雙相動作電位的前相總是高于后相。對這一結(jié)果的解釋如下，組成神經(jīng)干的各類神經(jīng)纖維具有不同的生理特性，每種纖維興奮后傳導(dǎo)速度各不一樣、波長也各不相等[13]。在動作電位的形成是以第一種(圖3)原理的情況下，即雙相動作電位第二相的形成是由于L1的復(fù)極化，而L2仍處于動作電位的去極化時，這時由于傳導(dǎo)速度的不同可能出現(xiàn)L1處的神經(jīng)纖維并沒有全部復(fù)極化，或L2處的神經(jīng)纖維沒有完全去極化。這就導(dǎo)致無論是粗的在刺激電極一側(cè)還是細端在刺激電極一側(cè)，雙相動作電位的前后相在幅度上的差別是由傳導(dǎo)速度造成的，由于L1距離刺激電極較近，因此傳導(dǎo)速度對L1影響沒有L2大。

如果L1L2之間的距離較大，BAP的產(chǎn)生就是本文所闡述的第二種原理，即使如此，雙相動作電位的幅度仍是前相大于后相，這一點則更容易用傳導(dǎo)速度解釋。以細端靠近刺激電極為例，動作電位傳至L1處產(chǎn)生一復(fù)合波上升支，動作電位傳離L1處產(chǎn)生復(fù)合波下降支，由于L1距離刺激電極較近，各纖維傳導(dǎo)速度雖有差別但影響有限。也正由于傳導(dǎo)速度的差別，及至動作電位傳至L2處時，在L2處產(chǎn)生興奮的神經(jīng)纖維數(shù)量要少于L1處。因此在L1靠近刺激電極時，L2的距離越遠，傳導(dǎo)速度對L2處參與興奮的神經(jīng)纖維的數(shù)量影響越大，動作電位前后相的差值也會越大[15]，如表2所示。

表2 L1L2之間的距離影響B(tài)AP前后相波的幅度差

4 結(jié) 語

綜上所述，采用坐骨神經(jīng)干上放置2個引導(dǎo)電極的細胞外記錄方法，利用動作電位在神經(jīng)干上的傳導(dǎo)引導(dǎo)雙相動作電位的產(chǎn)生，2個引導(dǎo)電極之間距離的不同使得所產(chǎn)生的雙相復(fù)合動作電位的機制不盡相同。通過本文的探討，增加對雙相動作電位產(chǎn)生機制的理解，但具體的膜通道變化還需要電生理學(xué)的證據(jù)，同時不同神經(jīng)纖維的不同的傳導(dǎo)速度對細胞外記錄引導(dǎo)雙相動作電位的影響也需進一步的實驗證實。

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Mechanism of Biphasic Action Potential on Toad’s Sciatic Nerve

WUQiong,ZHULiang

(Department of Physiology, Dalian Medical University, Dalian 116044, China)

Two recording electrodes were put on the outside of the toad’s sciatic nerve, the action potential (AP) on it was generated through a given maximum stimulus, and then the biphasic action potential (BAP) was recorded after the AP propagated along the sciatic nerve and passing through the two electrodes. The waves of BAP were observed when the distance between the two electrodes was increasing. The results showed that the former phase of BAP was always higher than the latter phase. The incisures appeared when the distance between the two electrodes increased. These results demonstrated that the space and time quality of BAP caused the wave change which explained the mechanism of BAP and got to know the bioelectricity of nerve more deeply.

biphasic action potential(BAP); sciatic nerve; electrophysiology

2015-01-22

國家自然科學(xué)基金項目(81370583；30801127)；遼寧省衛(wèi)生發(fā)展研究中心課題(LPRCHDC7)；中華醫(yī)學(xué)會醫(yī)學(xué)教育分會醫(yī)學(xué)教育研究課題(2012-KY-3)；遼寧省教育科學(xué)“十二五”規(guī)劃課題(JG13DB230)；遼寧省普通高等教育本科教學(xué)改革研究課題(UPRP20140824)

吳 瓊(1979-)，女，遼寧撫順人，博士，講師，現(xiàn)主要從事阿爾茨海默病的發(fā)病機制及電生理的研究。

Tel.:0411-86110288;E-mail:wqdlmedu@126.com

朱 亮(1974-)，男，遼寧鞍山人，教授，現(xiàn)從事移植與功能重建的研究。Tel.:0411-86110287;E-mail:zhuliang0210@sina.com

R 338.8

A

1006-7167(2015)11-0018-04