張淑芬， 楊紅軍， 鄧兵梅， 武肖娜

(1廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510010； 2廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510504)

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TNF-α在CCD模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的表達及機制*

張淑芬1, 2， 楊紅軍1△， 鄧兵梅1， 武肖娜1

(1廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510010；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510504)

目的： 探討TNF-α和NF-κB在背根神經(jīng)節(jié)慢性壓迫(CCD)模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中的表達變化及其對疼痛學(xué)行為的影響。方法: 建立CCD大鼠模型，采用von Frey纖維絲監(jiān)測機械痛閾的改變；通過Western blotting檢測TNF-α和NF-κB在DRG中的表達變化趨勢，分析其與疼痛行為之間的相關(guān)性；并采用免疫熒光雙染技術(shù)研究TNF-α在DRG中的表達位置。結(jié)果: CCD組的50%機械縮足閾值在術(shù)后1 d即開始明顯下降(P<0.01)，7～14 d達到高峰，其后逐漸上升，直至術(shù)后35 d仍明顯低于術(shù)前及sham組(P<0.01)。而DRG上的TNF-α及NF-κB于造模后各時點均顯著增多(P<0.01)，且TNF-α的表達趨勢與50%機械縮足閾值顯著相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論: DRG慢性壓迫可促進其上的TNF-α和NF-κB的合成和分泌，進而誘發(fā)機械痛覺過敏。因此，TNF-α/NF-κB信號通路可能是CCD模型疼痛形成的重要通路之一。

背根神經(jīng)節(jié)慢性壓迫模型； 背根神經(jīng)節(jié)； 腫瘤壞死因子α； 核因子κB

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病所直接引起的疼痛[1]。其發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚無統(tǒng)一定論。近年來，隨著對NP研究的深入，發(fā)現(xiàn)許多免疫細胞和炎性細胞因子在其形成和維持中發(fā)揮著重要作用，其中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)最為關(guān)鍵。大量研究證實TNF-α在各種不同神經(jīng)痛模型的不同組織如周圍神經(jīng)、背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)、脊髓、腦中均有一定程度升高[2-6]，但其機制不明。

TNF-α作為一種重要的前炎癥介質(zhì)，其可通過與細胞表面受體結(jié)合，激活I(lǐng)KK，引起IκBα磷酸化降解，使核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化，而活化的NF-κB轉(zhuǎn)移入細胞核，調(diào)控靶基因的表達。因此，本研究假設(shè)TNF-α/NF-κB信號通路為NP形成的重要通路之一，通過建立背根神經(jīng)節(jié)慢性壓迫(chronically compressed dorsal root ganglion，CCD)模型，研究TNF-α及NF-κB在此模型DRG中的表達規(guī)律，并探討TNF-α與疼痛行為學(xué)之間的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及分組

清潔級成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠35只，由廣東省實驗動物中心提供，體重200～250 g。實驗于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動物實驗中心進行，術(shù)前飼養(yǎng)5 d以適應(yīng)環(huán)境。隨機取10只作為假手術(shù)(sham)組，剩下的25只為CCD組。2組各取5只，分別于手術(shù)前2 d、1 d以及手術(shù)后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d和35 d進行行為學(xué)測定。同時，CCD組分別于術(shù)后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d和35 d取材，而sham組均于術(shù)后7 d取材。取得的DRG分別用于進行Western blotting和免疫熒光實驗。

2 實驗方法

2.1 模型建立方法 CCD模型的制備方法已有文獻報導(dǎo)[7]。將動物麻醉后，剪毛并消毒背部皮膚，俯臥位，于背部正中L4～5水平作一縱行切口，分離棘突左側(cè)皮下組織及肌肉，暴露左側(cè)第4、5腰椎(L4、L5)的椎間孔，將兩根L型不銹鋼柱(長4 mm,直徑0.5～0.8 mm)插入L4、L5椎間孔以形成對DRG的持續(xù)壓迫，此時可見左下肢肌肉輕微抽動，逐層縫合肌肉、皮膚。而sham組僅暴露L4、L5椎間孔，不插入L型鋼柱。

2.2 機械刺激撤足閾值的測定方法 50%機械刺激撤足閾值的測定采用Chaplan等[8]的Up-Down法：將大鼠置于透明有機玻璃箱中，底為0.5 cm×0.5 cm孔徑的鐵絲網(wǎng)。測試前3 d，讓大鼠每天在玻璃箱中適應(yīng)30 min以上。測試時，待大鼠安靜后，選8根不同強度(0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 g)的von Frey 纖維絲刺激大鼠左后肢足心部，每次持續(xù)時間3～5 s。以2.0 g為初始刺激強度，若撤足反應(yīng)為陰性則選用刺激強度遞增的相鄰纖維絲繼續(xù)刺激，若撤足反應(yīng)為陽性，則選擇相鄰遞減的強度給予刺激，如此類推，直至撤足反應(yīng)為陽性后再連續(xù)刺激5次。記錄測試結(jié)果，相關(guān)軟件計算50%機械撤足閾值。

2.3 Western blotting實驗 大鼠麻醉后，切開背部皮膚，剪去棘突、肌肉及后椎板，取下左側(cè)L4、L5 DRG。稱其重量，每100 g組織加入100 μL 含1%蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的SDS裂解液，組織剪碎后用超聲破碎儀將其充分裂解，4 ℃ 12 000×g離心20 min，取上清。BCA試劑盒測出蛋白濃度。各組分別取相同總量進行電泳、轉(zhuǎn)膜；將膜置于1∶200稀釋的TNF-α抗體(Abcam)、1∶500稀釋的NF-κB抗體(Abcam)和1∶1 000稀釋的β-actin抗體(CST)中，4 ℃搖床上孵育過夜，次日室溫內(nèi)復(fù)溫30 min；TBST洗10 min 3次；加入 II 抗，室溫搖床上孵育1 h；TBST洗10 min×3次；將膜置于凝膠拍攝系統(tǒng)的暗盒內(nèi)，加入ECL發(fā)光液，通過調(diào)節(jié)不同曝光時間來將目的條帶顯示出來，并拍照。最后用相關(guān)分析軟件比較不同組別目的蛋白之間的差異。

2.4 免疫熒光雙染方法 大鼠麻醉后，用250 mL生理鹽水快速心臟灌注，再用4%多聚甲醛，速度先快后慢，至大鼠完全僵硬。切開背部皮膚，剪去棘突、肌肉及后椎板，取下左側(cè)的L4、L5 DRG。先于4%多聚甲醛中后固定30 min，再用30%蔗糖脫水2 d。明膠包埋后連續(xù)冰凍切片，片厚16 μm。切片用5% BSA封閉1 h；全部切片滴加1∶50稀釋的小鼠來源的TNF-α抗體，并在需要雙染的切片中分別滴加1∶100的GFAP抗體(衛(wèi)星膠質(zhì)細胞染色)、1∶50的NF-200抗體(大神經(jīng)元染色)及1∶100的IB4抗體(小神經(jīng)元染色)(Abcam)，4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜，次日室溫復(fù)溫30 min；PBS洗10 min 3次；滴加結(jié)合Cy3抗小鼠 II 抗和FITC抗兔 II 抗，室溫避光孵育1 h；PBS避光洗10 min 3次。熒光顯微鏡拍照。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表達，采用SPSS 13.0軟件，利用t檢驗分析CCD組與sham組之間的疼痛行為學(xué)和TNF-α的表達是否有顯著差異，并用非線性回歸分析計算TNF-α與50%機械縮足閾值之間的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CCD模型大鼠的50%機械縮足閾值改變

CCD組大鼠損傷側(cè)的50%機械縮足閾值于術(shù)后1 d開始下降，與術(shù)前及sham組相比，均存在極顯著差異(P<0.01)。而于7～14 d時下降最明顯，其后開始逐漸回升，直至術(shù)后35 d，機械痛閾仍明顯低于術(shù)前和sham組(P<0.01)。同時，損傷對側(cè)的機械閾值于術(shù)后也持續(xù)低于術(shù)前和sham組(P<0.01)。而sham組沒有觀察到明顯的痛覺過敏現(xiàn)象, 各時點與術(shù)前相比無顯著差異，見表1。

2 TNF-α在CCD模型大鼠DRG上的表達情況

免疫熒光實驗結(jié)果證明，TNF-α在CCD模型大鼠DRG中的表達較sham組明顯增多。其在sham組的DRG無明顯著色，呈弱陽性表達(圖1A)，而造模7 d后TNF-α則呈強陽性表達，免疫物質(zhì)呈紅色(圖1B)。免疫熒光雙染結(jié)果顯示TNF-α與GFAP、NF-200及IB4均存在共染(圖1C～E)，表明其主要在大、中、小DRG神經(jīng)元及其周圍的衛(wèi)星膠質(zhì)細胞中表達。

Western blotting結(jié)果表明，TNF-α在sham組大鼠DRG中表達很弱，而CCD術(shù)后1 d開始增多，與sham組相比存在極顯著差異(P<0.01)。其表達于7～14 d達到高峰，隨后逐漸下降。直至實驗觀察結(jié)束(術(shù)后35 d)，其表達量與sham組之間仍有極顯著差異(P<0.01)，見圖1F。

表1 Sham組與CCD組于術(shù)前及術(shù)后各時點的50%機械痛閾

Table 1.The 50% paw withdrawal threshold of the rats in sham and CCD groups at different time points after CCD operation(g. Mean±SD,n=5)

Postoperativetime(d)ShamCCDIpsilateralContralateralIpsilateralContralateral-225.37±023.86±3.3823.86±3.3822.34±4.14-123.86±3.3822.34±4.1425.37±023.86±3.38118.76±7.3722.34±4.142.01±0.72**##6.27±3.44**##420.83±4.1420.83±4.141.37±1.32**##3.53±1.78**##722.34±4.1422.34±4.140.33±0.10**##2.16±0.75**##1020.83±4.1420.83±4.140.53±0.35**##2.26±0.80**##1422.34±4.1422.34±4.140.76±0.67**##2.04±0.81**##2123.86±3.3823.86±3.381.34±0.49**##3.45±2.31**##2825.37±025.37±02.92±1.50**##3.95±1.62**##3523.86±3.3823.86±3.383.05±1.65**##4.55±1.43**##

**P<0.01vspre-peration (postoperative -1 or -2 d);##P<0.01vssham.

Figure 1.The expression of TNF-α in the DRG of CCD group. A: the expression of TNF-α in sham group; B: the expression of TNF-α in CCD group; C～E: TNF-α expressed in all sizes of DRG neurons and the satellite glial cells; F: the expression of TNF-α in DRG at different time points after CCD detected by Western blotting. Mean±SD.n= 3.**P<0.01vssham.

圖1 TNF-α在CCD模型大鼠DRG中表達的位置及時間趨勢

3 DRG中TNF-α表達與50%機械縮足閾值之間的關(guān)系

CCD組大鼠DRG中TNF-α的表達與50%機械縮足閾值之間的非線性回歸方程為y=7.744e-2.748x(R2=0.643，n=6)，有顯著相關(guān)性。

4 p-NF-κB在CCD模型大鼠DRG上的表達趨勢

p-NF-κB在sham組大鼠DRG中表達較弱，CCD造模術(shù)后1 d開始增多，與sham組相比存在極顯著差異(P<0.01)；其表達于7 d達高峰，隨后逐漸下降，于術(shù)后28 d已恢復(fù)正常，與sham組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

Figure 2.The protein levels of p-NF-κB in the DRG of CCD group at different time points after CCD. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssham group.

圖2 CCD后不同時間p-NF-κB在大鼠DRG中的蛋白水平

討 論

慢性腰腿痛是一種常見的神經(jīng)病理性疼痛，由于腰椎的退行性變或腰部外傷，致使椎間盤突出、脊椎韌帶鈣化或骨質(zhì)增生，從而造成椎管和椎間孔狹窄，進而對DRG及其鄰近神經(jīng)根形成慢性壓迫，導(dǎo)致神經(jīng)組織水腫、變性，引起腰及下肢疼痛，但具體機制不明。本研究通過使用不銹鋼柱壓迫DRG，進而模擬腰椎間盤突出或腰椎管狹窄引起的神經(jīng)痛，從而探討其發(fā)病機制。

目前很多研究認為，在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，炎性細胞因子可能參與神經(jīng)痛的形成，其中TNF-α是較為確定的細胞因子之一。在神經(jīng)分支選擇性損傷、慢性壓迫損傷等周圍神經(jīng)損傷模型中，均發(fā)現(xiàn)脊髓和背根神經(jīng)節(jié)等部位的神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞中TNF-α表達明顯上調(diào)[5, 9]。而坐骨神經(jīng)周圍注入微量TNF-α也可引起明顯的痛覺過敏，其疼痛程度與劑量呈正相關(guān)[10]。上述研究均提示，TNF-α在神經(jīng)病理性疼痛的形成中起著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果表明，DRG慢性壓迫可引起其上的TNF-α明顯升高，且其表達趨勢與機械痛閾的進展變化呈指數(shù)關(guān)系。因此，我們推斷，DRG上TNF-α的過表達是引起機械痛覺過敏的重要原因之一。另外，免疫雙染實驗結(jié)果顯示，增多的TNF-α主要表達在DRG神經(jīng)元及其周圍的衛(wèi)星膠質(zhì)細胞上。這與既往的研究結(jié)果相似：周圍神經(jīng)損傷后，各類膠質(zhì)細胞增殖并被激活[11-12]，進而產(chǎn)生各種炎性因子；而DRG神經(jīng)元則通過激活其上的Toll樣受體，繼而引起自身TNF-α和p-p38上調(diào)[9, 13]。

TNF-α作為前炎性細胞因子，不僅可通過上調(diào)受損DRG神經(jīng)元的Na+離子通道[14](Nav1.1、Nav1.3和Nav1.8)，使自發(fā)放電增多，從而引起痛覺過敏[15]，還可通過MAPK、NF-κB等信號通路，促進自身及其它細胞因子的合成和分泌，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的瀑布效應(yīng)，以進一步參與神經(jīng)痛的維持。我們的結(jié)果提示，TNF-α及NF-κB均于壓迫早期開始明顯增多，兩者表達峰值幾乎一致。然而，TNF-α于術(shù)后1 d的增加倍數(shù)較NF-κB大；且NF-κB于術(shù)后7 d開始下降，直至28 d已基本恢復(fù)至正常水平，而TNF-α在術(shù)后14 d才開始逐漸減少，直至35 d，其表達量仍維持在較高水平。由此證明，DRG被壓迫后TNF-α迅速增多，參與神經(jīng)痛的發(fā)生；并通過啟動NF-κB信號通路促進自身的合成和分泌，以進一步維持神經(jīng)病理性疼痛。

綜上所述，在CCD模型中，TNF-α/NF-κB信號通路是引起神經(jīng)病理性疼痛的重要通路之一，其參與了機械痛覺過敏的發(fā)生與維持。

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中國病理生理學(xué)會第十屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議第一輪通知

中國病理生理學(xué)會第九屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議將于2015年11月6日至11月9日在天津賓館舉行。本次大會由中國病理生理學(xué)會主辦，天津醫(yī)科大學(xué)承辦。

大會主席由全國人民代表大會副委員長、中國科協(xié)主席、國際病理生理學(xué)會主席、中國病理生理學(xué)會理事長韓啟德院士擔任。在中國病理生理學(xué)會第九屆全國代表大會上，將審議中國病理生理學(xué)會第九屆理事會工作報告和章程修改報告，進行換屆選舉。

隨著基礎(chǔ)與臨床相關(guān)研究日益密切以及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)概念的深化，病理生理學(xué)科與臨床學(xué)科的相互交流和滲透的要求尤為迫切。因此，本次學(xué)術(shù)會議將對心血管、干細胞、腫瘤、免疫、炎癥及神經(jīng)生物學(xué)等多個領(lǐng)域進行廣泛的研討，邀請眾多國內(nèi)外著名學(xué)者和臨床工作者共聚一堂，從不同角度切磋共同關(guān)心的課題，以促進學(xué)科融合，繁榮學(xué)術(shù)交流，進而達到雙贏效果。同時，為了鼓勵與培養(yǎng)青年優(yōu)秀科研工作者，會議期間還將進行青年優(yōu)秀論文的評獎活動。

本次大會鼓勵參會代表積極向本次會議投稿，并擬對35歲以下(1980年10月30日以后出生)與會者的優(yōu)秀論文予以獎勵。由大會評審委員會選出優(yōu)勝者，頒發(fā)獎勵。大會只接受電子版摘要，請大家于2015年6月30日前登陸中國病理生理學(xué)會網(wǎng)站(http://www.caop.ac.cn/)進行在線投稿(在會議通知下方有網(wǎng)上提交系統(tǒng)，填寫相關(guān)信息后提交即可；請注明是否參加優(yōu)秀青年論文評比)。

中國病理生理學(xué)會第十屆全國代表大會組織委員會

2015 年 3月 31日

Expression and function of TNF-α in dorsal root ganglion of rats with chronically compressed dorsal root ganglion

ZHANG Shu-fen1, 2, YANG Hong-jun1, DENG Bing-mei1, WU Xiao-na1

(1DepartmentofNeurology,GuangzhouMilitaryGeneralHospital,Guangzhou510010,China;2GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510504,China.E-mail:neuroyhj@163.com)

AIM: To investigate the role of TNF-α and NF-κB in the mechanism of neuropathic pain due to chronically compressed dorsal root ganglion (CCD). METHODS: Based on the CCD model, von Frey filaments were used to quantify behavior test. The expression changes of TNF-α and NF-κB were determined by Western blotting, and the correlation between the expression of TNF-α and the 50% paw withdrawal threshold was also analyzed. Moreover, the location of TNF-α in dorsal root ganglion (DRG) was observed with immunofluorescence double staining. RESULTS: We found 50% paw withdrawal threshold of CCD decreased at the first day after operation. The mechanical allodynia was the most obvious at postoperative 7～14 d and lasted longer than 35 d. The expression of TNF-α and NF-κB increased significantly in DRG after operation (P<0.01), especially at 7～14 d, and then restored gradually. Moreover, there was a correlation between the protein expression of TNF-α and the changes of neuropathic behavior (P<0.05). CONCLUSION: TNF-α and NF-κB are involved in the mechanism of mechanical allodynia after chronically compressed DRG.

Chronically compressed dorsal root ganglion; Dorsal root ganglion; Tumor necrosis factor-α; Nuclear factor-κB

1000- 4718(2015)04- 0675- 05

2014- 11- 24

2015- 03- 04

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No. S2012010009849)；全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”科研面上項目(No. CWS11J272)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.018

△通訊作者 Tel: 020-88653321； E-mail: neuroyhj@163.com