周玲麗， 曹 驥， 李 薇 ， 羅 旺 ， 楊香娣 ， 楊 春， 駱成飄， 唐艷萍， 李 瑗

(1廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部, 2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣西 南寧 530021)

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RNA干擾FABP5基因?qū)θ烁伟〩epG2細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響*

周玲麗1,2， 曹 驥1△， 李 薇1,2， 羅 旺1,2， 楊香娣1,2， 楊 春1， 駱成飄1， 唐艷萍1， 李 瑗1

(1廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部,2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣西 南寧 530021)

目的： 研究脂肪酸結(jié)合蛋白5(FABP5)基因沉默的慢病毒載體對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞成瘤效應(yīng)的影響。方法: 采用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄慢病毒載體。HepG2細(xì)胞分為3組：實(shí)驗(yàn)組以FABP5基因沉默慢病毒顆粒(LV-shRNA-FABP5)感染HepG2細(xì)胞；陰性對(duì)照組以空載體慢病毒顆粒(LV-shRNA-NC)感染HepG2細(xì)胞；空白對(duì)照組不做任何處理。將裸鼠隨機(jī)分為3組，接種腫瘤細(xì)胞后觀察裸鼠成瘤情況。4周后測(cè)量腫瘤的體積和重量，繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。Real-time PCR、Western blot及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠移植瘤中FABP5的表達(dá)。結(jié)果: LV-shRNA-FABP5可以降低HepG2細(xì)胞FABP5的表達(dá)。3組裸鼠接種癌細(xì)胞后均有腫瘤形成。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減慢，且體積及重量明顯減小(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組裸鼠肝癌移植瘤組織的FABP5 mRNA和蛋白表達(dá)水平相比空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組表達(dá)明顯下降(P<0.05)。結(jié)論: 沉默F(xiàn)ABP5基因表達(dá)能有效抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。FABP5可能成為肝癌基因治療的一個(gè)有效靶點(diǎn)。

RNA干擾； 脂肪酸結(jié)合蛋白5； 肝癌； 裸鼠； 移植瘤； 基因治療

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)為常見(jiàn)的的惡性腫瘤之一，而且預(yù)后差。2007年全世界肝癌的死亡例數(shù)達(dá)到68 000，在全球的腫瘤死亡原因中位居第三，其中55%以上發(fā)生在中國(guó)[1]。發(fā)現(xiàn)和了解肝癌形成的關(guān)鍵分子對(duì)于研究肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制和實(shí)現(xiàn)基因的靶向治療有著重要的意義。脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding proteins，F(xiàn)ABPs)是一組多源性的小分子胞內(nèi)蛋白質(zhì)，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的小腸、肝臟、脂肪、心腦等多種細(xì)胞內(nèi)，其中表皮相關(guān)型又稱為FABP5。FABP5與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)的FABP5不僅可以轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量及原材料，而且可以結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)各種配體，參與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]。本課題組前期應(yīng)用跨種屬腫瘤基因篩選策略，篩選出多種作用于肝癌的關(guān)鍵分子，且通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)在肝癌中FABP5的表達(dá)顯著上調(diào)[3-5]。首先我們采用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了FABP5-shRNA慢病毒載體，沉默HepG2細(xì)胞中的FABP5基因，成功驗(yàn)證了其能明顯降低FABP5的表達(dá)。本研究通過(guò)構(gòu)建裸鼠肝癌移植瘤模型，觀察HepG2細(xì)胞中FABP5基因沉默后對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況的影響，從而進(jìn)一步探討FABP5在肝癌的發(fā)生發(fā)展中所起的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2和慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司；30只雌性BALB/c裸鼠，4～6 周齡，(16±3)g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào)：SCXK桂2009-0002)；DMEM、胎牛血清和PBS均購(gòu)自Hyclone；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa；Western blot及IP細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、5×SDS蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測(cè)試試劑盒(增強(qiáng)型)、20×TBS緩沖液等均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；蛋白質(zhì)預(yù)染Marker購(gòu)自Fermentas；PVDF膜購(gòu)自Millipore；兔抗人FABP5單克隆抗體購(gòu)自Abcam；兔抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；免疫組化SP試劑盒和DAB濃縮顯色液均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Real-time PCR儀購(gòu)自Bio-Rad。PCR引物采用Primer 5.0設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2用含10%胎牛血清，加1×105U/L左氧氟沙星的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 慢病毒載體轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2 轉(zhuǎn)染前12 h取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為6×105，按MOI=10的條件下，待細(xì)胞融合度達(dá)20%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)組中加入LV-shRNA-FABP5(干擾序列為5’-TGGGAAGGAAAGCACAATA-3’)，陰性對(duì)照組加入LV-shRNA-NC(干擾序列為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)，每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，每孔均加入polybrene及感染增強(qiáng)液，增強(qiáng)病毒的感染力?？瞻讓?duì)照組常規(guī)培養(yǎng)(control組)。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定嘌呤霉素的最終工作濃度為3 mg/L，轉(zhuǎn)染72 h后每孔加入嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，96 h后熒光最強(qiáng)，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況。之后使用含0.1 mg/L嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，保持病毒整合后的穩(wěn)定性。

2.3 構(gòu)建肝癌裸鼠移植瘤模型 按照隨機(jī)分組的原則將30只雌性裸鼠隨機(jī)分成3組，分別作為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，離心并計(jì)數(shù)后用血清制成約1×1010/L的細(xì)胞懸液，分別接種于3組裸鼠右腋下0.5 cm處，實(shí)驗(yàn)組接種轉(zhuǎn)染LV-shRNA-FABP5的HepG2細(xì)胞，陰性對(duì)照組接種轉(zhuǎn)染LV-shRNA-NC的HepG2細(xì)胞，空白對(duì)照組接種正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞。裸鼠在SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)， 4周后處死，完整剝離腫瘤組織后稱瘤體重量并計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積 (mm3)=長(zhǎng)徑×短徑2/2。取適當(dāng)瘤體組織置于-80 ℃冰箱中，用于做real-time PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)，剩余瘤體組織置于4%多聚甲醛溶液中固定做免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)瘤組織中FABP5 mRNA的表達(dá) Trizol法分別提取3組腫瘤組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。FABP5的上游引物為5’-TGAAGGAGCTAGGAGTGGGAA-3’，下游引物為5’-TGCACCATCTGTAAAGTTGCAG-3’；內(nèi)參照GAPDH的上游引物為5’ -TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物為5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。反應(yīng)體系為20 μL，SYBR 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，雙蒸水8 μL。采用2-ΔΔCt分析法，Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照。

2.5 Western blot檢測(cè)裸鼠移植瘤中FABP5蛋白的表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑測(cè)定蛋白濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。常?guī)制膠、上樣，進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳；轉(zhuǎn)膜；用TBST配制5%脫脂牛奶封閉1 h，然后FABP5和β-actin I抗4 ℃下孵育過(guò)夜(FABP5 的I抗稀釋度為1∶200)，第2天用TBST洗膜，室溫?fù)u床孵育II抗(II抗稀釋度均為1∶10 000)1 h，TBST洗膜5 min 3次。采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描，獲取圖像。

2.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤組織中FABP5蛋白的表達(dá) 從裸鼠右腋下取腫瘤組織，用4%多聚甲醛液固定，脫水后石蠟包埋腫瘤組織，連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟處理。實(shí)驗(yàn)過(guò)程采用SP法，步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。兔抗FABP5單克隆抗體1∶200稀釋，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)代替 I 抗作為陰性對(duì)照。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷：FABP5蛋白以細(xì)胞核或(和)細(xì)胞漿呈黃色顆粒為陽(yáng)性，綜合強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行判定。(1)按切片中細(xì)胞著色深淺評(píng)分：0分為細(xì)胞無(wú)顯色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。(2)按陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。取2項(xiàng)評(píng)分的乘積作為總評(píng)分：0分為陰性(-)；1～4分為弱陽(yáng)性(+)；5～8分為中等強(qiáng)度陽(yáng)性(++)；≥9分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。以乘積0～3分為陰性表達(dá)，≥4分為陽(yáng)性表達(dá)。其中以陰性(-)和弱陽(yáng)性(+)記為低表達(dá)組，以中陽(yáng)性(++)和強(qiáng)陽(yáng)性(+++)記為高表達(dá)組。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；免疫組化各計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 慢病毒感染HepG2細(xì)胞

在MOI值為10的條件下，實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組中綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)于72 h開(kāi)始表達(dá)，96 h表達(dá)穩(wěn)定增強(qiáng)。由圖可知96 h熒光顯微鏡下細(xì)胞轉(zhuǎn)染的情況，慢病毒感染HepG2細(xì)胞的效率>95%，圖1。

Figure 1.Human hepatocellular carcinoma HepG2 cells transfected with the recombinant lentivirial vector and GFP expression examined using fluorescence microscopy (×200).

圖1 慢病毒感染HepG2細(xì)胞

2 動(dòng)態(tài)觀察裸鼠移植瘤

大約1周左右，各組裸鼠右腋下均有肉眼可見(jiàn)的腫瘤長(zhǎng)出，成瘤率100%。從各組裸鼠成瘤開(kāi)始，分別在接種第1、2、3、4周測(cè)量移植瘤體積，然后繪制生長(zhǎng)曲線。4周連續(xù)觀察3組裸鼠的成瘤體積，結(jié)果得出實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)緩慢且體積明顯小于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組裸鼠成瘤28 d后，將裸鼠處死并完整剝離皮下腫瘤，測(cè)量腫瘤體積和重量，結(jié)果見(jiàn)圖2、3。各組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖4?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的瘤體平均體積分別為(100.51±47.45)mm3、(104.02±52.89)mm3和(29.41±8.98)mm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5；空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的瘤體重量平均分別為(0.632±0.203)g、(0.629±0.226)g和(0.204±0.067)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

Figure 2.The tumor formation of the nude mice 4 weeks after transplantation of HepG2 cells transfected with different RNAi lentiviral vectors.

圖2 4周后各組裸鼠移植瘤大小的比較

Figure 3.The volumes of the transplanted tumors 4 weeks after transplantation of HepG2 cells transfected with different RNAi lentiviral vectors.

圖3 4周后各組裸鼠移植瘤大小的比較

Figure 4.The growth curves of the subcutaneously transplanted tumors in the nude mice. Mean±SD.n=10.

圖4 裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)曲線

Figure 5.The changes of the tumor volumes in the nude mice 28 d after transplantation. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol.

圖5 28 d后各組裸鼠移植瘤體積的比較

Figure 6.The changes of the tumor weight in the nude mice 28 d after transplantation. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol.

圖6 28 d后各組裸鼠移植瘤重量的比較

3 Real-time PCR檢測(cè)各組裸鼠皮下移植瘤中FABP5 mRNA的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組瘤組織中FABP5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.112±0.107、1.068±0.114和0.145±0.046。實(shí)驗(yàn)相比陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖7。

4 Western blot檢測(cè)各組裸鼠皮下移植瘤組織中FABP5蛋白表達(dá)

以β-actin為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)組分別與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，F(xiàn)ABP5蛋白水平均減少達(dá)80%以上，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果提示RNA干擾沉默F(xiàn)ABP5基因可顯著減少裸鼠移植瘤組織中的FABP5蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖 8。

Figure 7.The effects of LV-shRNA-FABP5 on the mRNA expression of FABP5 in the subcutaneous tumor tissues detected by real-time PCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol.

圖7 Real-time PCR檢測(cè)LV-shRNA-FABP5對(duì)裸鼠移植瘤FABP5 mRNA表達(dá)的影響

Figure 8.The relative protein levels of FABP5 in the subcutaneous tumor tissues determined by Western blot. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol.

圖8 FABP-5蛋白在各組移植瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量

5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)移植瘤組織FABP5蛋白表達(dá)情況

裸鼠肝癌移植瘤組織表達(dá)FABP5陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞漿中，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色(圖9)。實(shí)驗(yàn)組中FABP5蛋白的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。這表明實(shí)驗(yàn)組FABP5蛋白表達(dá)在RNA干擾后顯著減少。

討 論

FABP5是FABPs的家族成員之一，主要來(lái)源于表皮細(xì)胞，分子量為15 kD，由135個(gè)氨基酸組成，其編碼基因已被克隆和測(cè)序，位于人8號(hào)染色體的q21.13區(qū)。FABP5主要參與脂肪酸的運(yùn)輸代謝、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)等[6]。FABP5作為維甲酸(retinoic acid，RA)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)RA，活化過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 β/δ(peroxisome proliferator-activated receptor β/δ，PPARβ/δ)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞的凋亡[7]。研究發(fā)現(xiàn)FABP5與多種腫瘤有關(guān)，早在1999年就發(fā)現(xiàn)在胰腺癌的耐藥細(xì)胞株該基因表達(dá)上調(diào)。此外，在黑色素瘤[8]、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌[9]、子宮內(nèi)膜癌[10]等腫瘤中FABP5的表達(dá)量均增加。Forootan等[11]用前列腺PC-3M細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi)，成瘤后將FABP5小干擾RNA注射到腫瘤周圍，結(jié)果腫瘤的平均大小比對(duì)照組小3倍以上；免疫組織化學(xué)和Wes-tern blot提示實(shí)驗(yàn)干擾組瘤組織中FABP5蛋白的表達(dá)水平低于對(duì)照組，推測(cè)FABP5水平下調(diào)可以抑制前列腺癌的發(fā)生。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)乳腺癌中FABP5表達(dá)高的患者預(yù)后差，F(xiàn)ABP5基因的表達(dá)情況是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。Uma等[13]研究比較舌鱗狀細(xì)胞癌的原位癌組織和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織，發(fā)現(xiàn)有67%的原位癌組織FABP5 mRNA表達(dá)量是其轉(zhuǎn)移后的癌組織中表達(dá)量的4倍，提示FABP5不但可以促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生，還參與其轉(zhuǎn)移過(guò)程。

Figure 9.The protein expression of FABP5 in the subcutaneous tumor tissues detected by immunohistochemical staining (×400).

圖9 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)FABP5蛋白在各組移植瘤組織中的表達(dá)

表1 FABP5在各組移植瘤組織中的表達(dá)

*P<0.05vscontrol.

本研究構(gòu)建了人肝癌裸鼠移植瘤模型，將FABP5基因沉默重組慢病毒顆粒(LV-shRNA- FABP5)組、空載體慢病毒顆粒(LV-shRNA-NC)組和空白對(duì)照組3組腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)后分別種植于裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)3組接種后均可見(jiàn)成瘤，但實(shí)驗(yàn)組的成瘤速度和瘤體積大小明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。人肝癌HepG2細(xì)胞株異體移植成功率達(dá)到100%，說(shuō)明通過(guò)皮下注射成瘤建立的人肝癌裸鼠移植瘤模型是可行的。Real-time PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果中，實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織中FABP5的mRNA和蛋白表達(dá)水平均比其它2組顯著降低。免疫組織化學(xué)法顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織中FABP5蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率明顯下降。

綜上所述，RNA干擾技術(shù)沉默人肝癌HepG2細(xì)胞中FABP5基因不僅能夠明顯抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，而且可以降低瘤組織FABP5的表達(dá)水平。因此，F(xiàn)ABP5基因有望成為肝癌個(gè)性化靶向治療研究的新方向。

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Effects of RNA interference ofFABP5 on subcutaneous tumor of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 transplanted in nude mice

ZHOU Ling-li1, 2, CAO Ji1, LI Wei1, 2, LUO Wang1, 2, YANG Xiang-di1, 2, YANG Chun1, LUO Cheng-piao1, TANG Yan-ping1, LI Yuan1

(1ResearchDepartment,GuangxiCancerInstituteofGuangxiZhuangAutonomousRegion,2GraduateSchoolofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:caojicn@163.com)

AIM: To investigate the effect of recombinant lentiviral vector for RNA interference (RNAi) on the expression of fatty acid-binding protein 5 (FABP5) gene in hepatocellular carcinoma HepG2 cells and tumor formation in nude mice. METHODS: RNAi lentiviral vector was used in the experiment. Human hepatocellular carcinoma HepG2 cells were divided into 3 groups: the HepG2 cells in experimental group were transfected with the recombinant lentivirirus vector LV-shRNA-FABP5, the cells in negative control group were transfected with a control lentiviral vector LV-shRNA-NC, and the cells in normal control group were without any treatment. The nude mice were randomly divided into 3 groups. The growth of the transplanted tumor cells in the nude mice was observed. The tumor growth curve, volume and weight were determined 4 weeks after the cell inoculation. The expression of FABP5 was detected by real-time PCR, Western blot and immunohistochemical staining. RESULTS: Transfection of the lentiviral vector FABP5-shRNA obviously reduced FABP5 expression in the HepG2 cells. Tumor formation was all positive in the 3 groups of the nude mice inoculated with the tumor cells. Compared with normal control group and negative control group, the tumor growth slowed significantly in experimental group with smaller volume and weight. FABP5 expression in the transplanted tumor tissues was significantly down-regulated at mRNA and protein levels in experimental group as compared with normal control group and negative control group. CONCLUSION: RNAi-induced down-regulation ofFABP5 effectively inhibits the growth of transplanted hepatocellular carcinoma, suggesting thatFABP5 gene may be an effective target for gene therapy in treating liver cancer.

RNA interference; Fatty acid-binding protein 5; Liver cancer; Nude mice, Neoplasm transplantation; Gene therapy

1000- 4718(2015)04- 0603- 06

2014- 10- 30

2014- 12- 19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30960428)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.005

△通訊作者 Tel: 0771-5310593; E-mail: caojicn@163.com