劉 鵬， 劉 俊， 薛蕓霞， 宋 方， 王寒晴， 傅 婷， 夏潮涌， 李志杰, △

(暨南大學(xué) 1再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2醫(yī)學(xué)院眼科研究所， 3醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，廣東 廣州 510632)

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擾亂晝夜節(jié)律對(duì)小鼠角膜創(chuàng)傷修復(fù)的影響*

劉 鵬1， 劉 俊1， 薛蕓霞2， 宋 方1， 王寒晴1， 傅 婷2， 夏潮涌3， 李志杰1, 2△

(暨南大學(xué)1再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2醫(yī)學(xué)院眼科研究所，3醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，廣東 廣州 510632)

目的： 本研究旨在觀察晝夜節(jié)律對(duì)角膜創(chuàng)傷修復(fù)的影響。方法: 選用C57BL/6雄性小鼠，在小鼠角膜中央直徑為2 mm的圓形區(qū)域，用高爾夫樣刀機(jī)械性去除其上皮層，使用熒光素鈉顯色創(chuàng)傷面積，動(dòng)態(tài)觀察上皮層修復(fù)的動(dòng)力學(xué)，并觀察白細(xì)胞、血小板和分裂細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果: 全晝(12 h light/12 h light, LL)和全夜(12 h dark/12 h dark, DD)組角膜創(chuàng)傷修復(fù)速率小于對(duì)照組(12 h light/12 h dark, LD)，表現(xiàn)為再上皮化延遲、上皮細(xì)胞數(shù)量降低、血管擴(kuò)張直徑增大、白細(xì)胞和血小板募集的發(fā)生延遲，但白細(xì)胞和血小板數(shù)目顯著增多。結(jié)論: 擾亂晝夜節(jié)律延遲炎癥反應(yīng)的發(fā)生，但加劇炎癥反應(yīng)；延遲再上皮化過程，最終顯著抑制角膜創(chuàng)傷修復(fù)過程。

角膜； 晝夜節(jié)律； 創(chuàng)傷修復(fù)； 炎癥反應(yīng)

角膜上皮修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括損傷區(qū)域的炎癥反應(yīng)，細(xì)胞的增殖、遷移。具體過程為：角膜上皮損傷觸發(fā)炎癥反應(yīng)，血管內(nèi)皮發(fā)生明顯的功能和形態(tài)的改變，血管內(nèi)皮表面表達(dá)特異性黏附分子使血管黏附性增加，從而誘導(dǎo)白細(xì)胞從角膜緣血管滲出，并遷移到損傷區(qū)域清除死亡、壞死的組織；伴隨著炎癥的消退，角膜快速再上皮化，白細(xì)胞的數(shù)目恢復(fù)至正常水平，基底細(xì)胞重新填充角膜基質(zhì)[1]。

晝夜節(jié)律是生物為適應(yīng)外界環(huán)境的晝夜變化，使機(jī)體活動(dòng)產(chǎn)生約為24 h周期變化的生理現(xiàn)象。在哺乳動(dòng)物中，晝夜節(jié)律系統(tǒng)由下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)和外周組織的外周時(shí)鐘構(gòu)成。SCN是晝夜節(jié)律的起搏點(diǎn)，可調(diào)控自身組織節(jié)律，還可通過神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌、體液等途徑影響外周時(shí)鐘。外周時(shí)鐘存在于心臟、肝臟、腎臟和肺等幾乎所有的組織器官中[2]。SCN協(xié)同外周時(shí)鐘使哺乳動(dòng)物的晝夜節(jié)律與環(huán)境保持同步，保證生理活動(dòng)協(xié)調(diào)。同其它外周組織和器官一樣，眼組織的許多生理活動(dòng)也表現(xiàn)出晝夜節(jié)律性。臨床數(shù)據(jù)表明：眼內(nèi)壓[3]、眼軸長度[3]、脈絡(luò)膜厚度[4]呈日周期變化。但有關(guān)角膜晝夜節(jié)律的研究非常少。早期初步的研究顯示，角膜厚度節(jié)律性改變[5]，在睡眠期角膜厚度增大，覺醒后數(shù)小時(shí)內(nèi)角膜厚度急劇變小。放射自顯影技術(shù)顯示，在大鼠中，角膜上皮細(xì)胞DNA的合成呈周期性變化，在6：00～12：00出現(xiàn)波峰，在20：00出現(xiàn)波谷[6]。

擾亂晝夜節(jié)律增加了疾病的發(fā)生概率。改變?nèi)说淖飨r(shí)間容易造成新陳代謝紊亂、心血管疾病的發(fā)生[7]，輪班工作增加患癌癥、糖尿病、中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)[8]。大鼠敗血癥模型中，全晝(12 h light/12 h light, LL)和全夜(12 h dark/12 h dark, DD)條件下的大鼠比晝夜(12 h light/12 h dark, LD)條件下存活率低[9]。這些研究提示正常晝夜節(jié)律有抵抗疾病的作用，其原因可能是機(jī)體能預(yù)測外界日周期的變化。角膜是視覺系統(tǒng)感受外界光線刺激過程中最重要的屈光裝置之一，直接與外界接觸極易發(fā)生外傷性損害，因此，了解角膜組織生理活動(dòng)的晝夜節(jié)律對(duì)角膜創(chuàng)傷修復(fù)具有重要意義。

本文研究晝夜節(jié)律對(duì)角膜創(chuàng)傷修復(fù)的影響，分別觀察了正常晝夜節(jié)律和擾亂晝夜節(jié)律條件下角膜上皮修復(fù)的動(dòng)力學(xué)，以及觀察炎性白細(xì)胞、血小板和分裂細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

6～8周齡C57BL/6雄性小鼠，體重18～22 g，購于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用過程嚴(yán)格遵守ARVO申明和暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定。

PE直標(biāo)的大鼠抗小鼠CD31、CD41抗體以及FITC直標(biāo)的大鼠抗小鼠CD41、Gr-1抗體均購自BD；DAPI染色液購自碧云天生物試劑公司；水合氯醛、熒光素鈉、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和Triton X-100購自廣州斯佳生物技術(shù)有限公司；環(huán)鉆和高爾夫樣刀購自Accutome。

2 方法

2.1 動(dòng)物處理 參照文獻(xiàn)[10]，LD組小鼠7:00～19:00接受光照(光照強(qiáng)度300 lux)，19：00～次日7：00停止光照，LL組24 h光照(光照強(qiáng)度300 lux)，DD組24 h黑暗，在(24±2) ℃的清潔級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)至少12 d，飼養(yǎng)過程中自由進(jìn)食。

2.2 角膜創(chuàng)傷動(dòng)物模型 參照文獻(xiàn)[11]，腹腔注射10%水合氯醛(0.05～0.1 mL)麻醉小鼠。解剖鏡下使用環(huán)鉆在角膜中央標(biāo)記直徑為2 mm的圓形區(qū)域，采用高爾夫樣刀機(jī)械性刮除標(biāo)記區(qū)的上皮細(xì)胞層，在此過程勿損傷基質(zhì)層。創(chuàng)傷后不同時(shí)點(diǎn)使用熒光素鈉染色顯示創(chuàng)傷面積，獲取圖像并分析創(chuàng)傷修復(fù)動(dòng)力學(xué)。

2.3 免疫熒光標(biāo)記 獲取具有完整角膜緣的角膜組織，依次在2%甲醛固定40 min、2% BSA封閉15 min、0.2% Triton X-100透膜15 min，再用FITC直標(biāo)的Gr-1、PE直標(biāo)的CD31、PE直標(biāo)的CD41單抗分別標(biāo)記白細(xì)胞、角膜緣微血管、血小板，所有抗體均以1∶50稀釋。為使鋪片平整，將角膜徑向切割成4片，用含DAPI的抗熒光淬滅緩沖甘油封片劑封片，同時(shí)可用來分析細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞增殖情況。

2.4 定量分析 每組實(shí)驗(yàn)至少選取5個(gè)角膜統(tǒng)計(jì)角膜上皮分裂細(xì)胞數(shù)目、白細(xì)胞數(shù)目、血小板數(shù)目、血管直徑。血管直徑、血小板數(shù)據(jù)的獲?。涸?0倍物鏡下隨機(jī)選取角膜緣血管網(wǎng)8個(gè)不同的視野并拍照；角膜上皮分裂細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)據(jù)的獲?。涸诰纸悄さ?條直徑上，用40倍物鏡均勻獲取9個(gè)視野并拍照，累計(jì)每條直徑上的細(xì)胞總數(shù)。用Image-Pro Plus 5.1軟件測量血管直徑和統(tǒng)計(jì)白細(xì)胞、分裂細(xì)胞、血小板數(shù)目。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用t檢驗(yàn)比較各組數(shù)據(jù)的差異性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 角膜創(chuàng)傷動(dòng)力學(xué)

LD、LL和DD組在同一時(shí)點(diǎn)創(chuàng)傷，在創(chuàng)傷后0 h、12 h、18 h、24 h用上述方法統(tǒng)計(jì)創(chuàng)傷面積。3個(gè)組的創(chuàng)傷區(qū)域均在創(chuàng)傷后24 h愈合，但LL和DD組的創(chuàng)傷面積在創(chuàng)傷后12 h、18 h顯著大于LD組(P<0.01)，見圖1A、B。

此外，在創(chuàng)傷后0 h、6 h、12 h、18 h、24 h，統(tǒng)計(jì)LD、LL、DD組角膜上皮分裂細(xì)胞數(shù)目。LL組在創(chuàng)傷后12 h、18 h分裂細(xì)胞數(shù)目顯著少于LD組(P<0.01)；DD組在創(chuàng)傷后12 h、18 h、24 h分裂細(xì)胞數(shù)目也顯著少于LD組(P<0.01)，見圖1C、D。

Figure 1.Dynamics of corneal wound healing. A: the stages of re-epithelialization revealed by fluorescein staining at 0 h, 12 h, 18 h and 24 h after central epithelial abrasion; B: percentage of the original wound area was plotted over time and was calculated from the area of fluorescein staining at each time point; C: dividing cells (arrows) stained with DAPI to reveal chromatin in the cornea; D: epithelial cell division counted after abrasion each 6 h. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs LD group.

2 擾亂晝夜節(jié)律對(duì)血管直徑的影響

LD組在整個(gè)創(chuàng)傷修復(fù)過程中，動(dòng)、靜脈直徑?jīng)]有發(fā)生顯著變化。LL和DD組在創(chuàng)傷后6 h、12 h、18 h動(dòng)脈和靜脈顯著擴(kuò)張，表現(xiàn)為：LL組動(dòng)、靜脈血管直徑在創(chuàng)傷后6 h急性擴(kuò)張，均在創(chuàng)傷后6 h達(dá)到最大值，直到創(chuàng)傷后18 h靜脈血管持續(xù)處于最大擴(kuò)張狀態(tài)；DD組動(dòng)、靜脈血管在創(chuàng)傷后6 h則緩慢擴(kuò)張，動(dòng)、靜血管分別在創(chuàng)傷后18 h、12 h達(dá)到最大值，見圖2。

3 擾亂晝夜節(jié)律對(duì)血小板募集的影響

LD組血小板數(shù)目在創(chuàng)傷12 h達(dá)到最大值，之后下降并趨于穩(wěn)定，其數(shù)目均處于較低水平。LL和DD組在創(chuàng)傷后6 h角膜緣血小板的數(shù)目顯著少于LD組(P<0.01)，之后LL和DD組血小板數(shù)目開始急劇增加，創(chuàng)傷后12 h、18 h和24 h的數(shù)目顯著大于LD組(P<0.01)，均在創(chuàng)傷后12 h達(dá)到最大值，見圖3。

4 擾亂晝夜節(jié)律對(duì)角膜白細(xì)胞數(shù)目的影響

在創(chuàng)傷后0 h、6 h、12 h、18 h、24 h，分別統(tǒng)計(jì)了整個(gè)角膜白細(xì)胞的數(shù)目。在創(chuàng)傷后6 h，LL和DD組白細(xì)胞數(shù)目少于LD組(P<0.01)；但在創(chuàng)傷后12 h、18 h，LL和DD組白細(xì)胞數(shù)目顯著多于LD組(P<0.01)；創(chuàng)傷后24 h，LL組白細(xì)胞數(shù)目多于LD組(P<0.05)，DD組白細(xì)胞數(shù)目少于LD組(P<0.05)。LL組白細(xì)胞數(shù)目在創(chuàng)傷后18 h達(dá)到最大值；DD組在創(chuàng)傷后12 h達(dá)到最大值，見圖4。

Figure 2.Effects of disruption of circadian rhythms on the vascular diameter in corneal limbus. A: changes of the arteriole diameter after corneal epithelial abrasion; B: changes of the venule diameter after abrasion; C: fluorescence microscopy image of the vessel stained with anti-CD31-PE. A is arteriole and V is venule, respectively. Mean±SD. n=5. *P<0.05, **P<0.01 vs LD group.

Figure 3.The effect of disruption circadian rhythms on platelets in corneal limbus. A: the number of platelets in corneal limbus after abrasion; B: the image of the platelet and blood vessels. Platelets were stained with anti-CD41-PE antibody in red, and blood vessels were stained with anti-CD31-FITC antibody in green. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs LD group.

Figure 4.The effect of disruption circadian rhythms on neutrophils in cornea. A: dynamics of neutrophils in cornea after central epithelial abrasion; B: fluorescence microscopy image of the neutrophils stained with anti-Gr-1-FITC. Mean±SD. n=5. *P<0.05, **P<0.01 vs LD group.

討 論

本研究表明擾亂晝夜節(jié)律后，小鼠角膜創(chuàng)傷修復(fù)速率延緩，表現(xiàn)為：再上皮化延遲、上皮細(xì)胞數(shù)量降低、血管擴(kuò)張直徑增大、白細(xì)胞和血小板募集的發(fā)生延遲但募集數(shù)目過度增加。

在眼組織中，眼內(nèi)壓[3]、脈絡(luò)膜厚度[4]、角膜厚度[5]、眼軸長度[3]等呈日周期變化。放射自顯影研究顯示角膜上皮細(xì)胞DNA合成存在節(jié)律性[6]，斑馬魚腸道細(xì)胞分裂具有節(jié)律性[12]。角膜緣區(qū)的干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷十分敏感，可以迅速進(jìn)入細(xì)胞分裂期來提供基底細(xì)胞。當(dāng)上皮細(xì)胞受到損害時(shí)，基底細(xì)胞可迅速進(jìn)行分裂補(bǔ)充創(chuàng)傷區(qū)域，完成再上皮化過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，擾亂晝夜節(jié)律創(chuàng)傷后角膜上皮分裂細(xì)胞數(shù)目降低，即細(xì)胞分裂速率減慢。因此，晝夜節(jié)律紊亂是直接影響角膜上皮細(xì)胞分裂速率的部分原因。

正常的晝夜節(jié)律是免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能的必要條件，晝夜節(jié)律紊亂會(huì)影響免疫系統(tǒng)的功能。炎癥反應(yīng)是組織創(chuàng)傷后完成修復(fù)的一個(gè)必經(jīng)過程[13]，包括微血管結(jié)構(gòu)與功能的變化、血小板和白細(xì)胞的募集。為了得到更多證據(jù)，我們進(jìn)一步研究了晝夜節(jié)律對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。

微血管是整個(gè)炎癥反應(yīng)發(fā)生和維持的關(guān)鍵部位。在創(chuàng)傷早期，炎癥因子和其它因子刺激血管擴(kuò)張、血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙擴(kuò)大、黏附分子表達(dá)增加等，促使炎癥細(xì)胞向創(chuàng)傷區(qū)域遷移和募集[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，擾亂晝夜節(jié)律血管直徑顯著擴(kuò)張。因此，我們推測擾亂晝夜節(jié)律會(huì)加劇炎癥反應(yīng)。此外，血管直徑的變化必然會(huì)引起與之相關(guān)的調(diào)節(jié)因子如血小板的變化。

血小板是炎癥反應(yīng)中的循環(huán)哨兵，受到刺激后能在短時(shí)間內(nèi)釋放大量的趨化因子和免疫調(diào)節(jié)因子等炎癥反應(yīng)因子[15]。目前已知血小板在炎癥反應(yīng)中的功能有：(1) 直接調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的活性；(2) 直接黏附在血管壁上調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性進(jìn)而為白細(xì)胞提供更多附著位點(diǎn)；(3) 參與病原體的捕獲、隔離；(4) 直接殺死病原體。最近研究發(fā)現(xiàn)，在角膜創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)期間，血小板參與白細(xì)胞在角膜緣血管的黏附、遷移、募集過程，并參與角膜創(chuàng)傷后再上皮化和上皮細(xì)胞增殖過程[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，擾亂晝夜節(jié)律角膜緣血小板募集的發(fā)生延遲，但募集的強(qiáng)度增加。驗(yàn)證了上述推測，擾亂晝夜節(jié)律加劇了炎癥反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道血小板與白細(xì)胞在角膜發(fā)生聚集的速率和強(qiáng)度具有一致性[16]。因此，我們推測白細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)過程中具有類似的過程。

白細(xì)胞被稱為人體的“衛(wèi)士”。當(dāng)組織受到損傷或者病菌入侵，白細(xì)胞能通過變形而穿過毛細(xì)血管壁，聚集至損傷或被入侵部位[17]。白細(xì)胞的主要作用是：(1) 分泌化學(xué)物質(zhì)和酶類殺死微生物和清除受損、壞死組織，為上皮細(xì)胞的遷移提供一個(gè)相對(duì)“干凈且無菌”的環(huán)境；(2) 釋放趨化因子和生長因子，觸發(fā)并維持后期的炎癥反應(yīng)與修復(fù)過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示擾亂晝夜節(jié)律延遲白細(xì)胞往角膜組織遷移的發(fā)生，但增加了白細(xì)胞的數(shù)目。進(jìn)一步驗(yàn)證擾亂晝夜節(jié)律會(huì)加劇炎癥反應(yīng)。

擾亂晝夜節(jié)律會(huì)影響免疫系統(tǒng)的功能。許多文獻(xiàn)進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道，晝夜節(jié)律紊亂的小鼠外周組織巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌量增加，受LPS刺激死亡率更高[18]；擾亂小鼠晝夜節(jié)律，發(fā)現(xiàn)有更多的TH17細(xì)胞生成并大量聚集在腸道中[19]；在小鼠活躍期，對(duì)病原體及其產(chǎn)物高度敏感，把處于活躍期的小鼠暴露在強(qiáng)光下，可導(dǎo)致小鼠發(fā)生過敏反應(yīng)降低其存活率[20]。這些研究證實(shí)了晝夜節(jié)律紊亂會(huì)導(dǎo)致免疫功能失調(diào)，加劇炎癥的發(fā)生，但其機(jī)制沒有完全研究清楚，可能的原因有：(1) 晝夜節(jié)律紊亂導(dǎo)致黏附分子和趨化因子分泌量增加，促進(jìn)白細(xì)胞流入組織中，而過多活躍的白細(xì)胞進(jìn)入組織易導(dǎo)致組織損傷；(2) 擾亂晝夜節(jié)律會(huì)干擾小鼠在不同時(shí)期對(duì)發(fā)現(xiàn)和消滅病原體的反應(yīng)靈敏度，也會(huì)影響免疫成分的表達(dá)；(3) 白細(xì)胞在不同時(shí)間吞噬能力和細(xì)胞毒性不同。

綜上所述，擾亂晝夜節(jié)律從2個(gè)方面影響角膜創(chuàng)傷修復(fù)過程：(1)直接影響上皮細(xì)胞的分裂速率；(2)干擾炎癥反應(yīng)，主要表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)的發(fā)生延遲且反應(yīng)強(qiáng)度增強(qiáng)。這些影響最終抑制角膜創(chuàng)傷修復(fù)過程。但晝夜節(jié)律系統(tǒng)是如何協(xié)調(diào)角膜創(chuàng)傷修復(fù)的各個(gè)過程以及分子機(jī)制，需要進(jìn)一步深入的研究。

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Disruption of circadian rhythms inhibits wound healing of corneal epithelium in mice

LIU Peng1, LIU Jun1, XUE Yun-xia2, SONG Fang1, WANG Han-qing1, FU Ting2, XIA Chao-yong3, LI Zhi-jie1, 2

(1KeyLaboratoryforRegenerativeMedicine,MinistryofEducation,2InstituteofOphthalmology,3DepartmentofHistology&Embryology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:zhijielee@yahoo.com)

AIM: To observe the effect of circadian rhythms on wound healing of mouse corneal epithelium. METHODS: The C57BL/6 male mice were used in the study. A part of corneal epithelium (2 mm in diameter) was struck off by a golf-like knife to form a round wound area. The dynamics of epithelial healing in the wound area were observed under microscope with fluorescein staining. In addition, with related antibodies and DAPI, the dynamic changes of the neutrophils, platelets and dividing cells were also investigated. RESULTS: The healing rates in LL group (12 h light/12 h light) and DD group (12 h dark/12 h dark) were obviously slower than that in LD group (12 h light/12 h dark), mainly showing delayed re-epithelialization, decreased epithelial cells, increased diameter of blood vessel, and delayed recruitment of neutrophils and platelets, but more cell number. CONCLUSION: Disruption of circadian rhythms significantly inhibits the wound healing of corneal epithelium, mainly through delaying the inflammation and re-epithelialization, but aggravating the inflammatory responses.

Cornea; Circadian rhythms; Wound healing; Inflammation

1000- 4718(2015)03- 0499- 06

2014- 12- 09

2015- 01- 22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30672287；No. 30772387；No. 81070703)

△通訊作者 Tel: 020-85226413； E-mail: zhijielee@yahoo.com

R363; R779.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.020