鄧智平， 廖和和， 王周權， 楊 波， 宋張駿， 姚俊濤， 任 宏， 張明鑫

(1西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院胸外二科， 2陜西省腫瘤醫(yī)院乳腺科，陜西 西安 710061；3第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院，陜西 西安 710000)

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c-Met對三陰性乳腺癌細胞增殖及阿霉素耐藥性的影響*

鄧智平1,2△， 廖和和1， 王周權1， 楊 波1， 宋張駿1， 姚俊濤1， 任 宏1， 張明鑫3

(1西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院胸外二科，2陜西省腫瘤醫(yī)院乳腺科，陜西 西安 710061；3第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院，陜西 西安 710000)

目的： 研究c-Met對三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231活力及對阿霉素耐藥性的影響。方法: 構建阿霉素耐藥的MDA-MB-231/ADR細胞系，實時熒光定量PCR及Western blotting技術檢測不同細胞系中c-Met mRNA及蛋白的表達。脂質(zhì)體轉染c-Met-siRNA及表達質(zhì)?；駻KT-siRNA，Western blotting檢測轉染效率；四甲基偶氮唑法(MTT法)檢測細胞的活力及對阿霉素的敏感性。結果: 對阿霉素耐藥的MDA-MB-231/ADR細胞中c-Met的mRNA及蛋白表達均顯著高于對照的MDA-MB-231細胞，轉染高表達c-Met的質(zhì)粒可增加MDA-MB-231細胞的活力并降低其對阿霉素的敏感性，而利用siRNA抑制耐藥細胞株中c-Met的表達后，可以逆轉MDA-MB-231/ADR細胞對阿霉素的耐藥。此外，c-Met可以磷酸化激活細胞中的AKT，并通過該信號分子增加MDA-MB-231細胞活力并誘導耐藥。結論: c-Met可作為一個重要的靶點應用于三陰性乳腺癌的治療。

c-Met； 三陰性乳腺癌； 細胞增殖； 阿霉素； 耐藥性

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是一種不表達雌、孕激素受體和人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)的乳腺癌亞型，臨床上表現(xiàn)為發(fā)病年齡輕，腫塊較大，組織學分化差，易發(fā)生遠處轉移[1]。由于缺少激素受體及HER2靶點，不能從內(nèi)分泌治療及靶向治療中獲益，故化療仍為TNBC治療的重要手段之一。對于早期TNBC，其對化療藥物的敏感性高于其它類型的乳腺癌，但隨著疾病的進展，TNBC往往表現(xiàn)出一定的耐藥性，使得晚期TNBC的預后極差[2]。因此，發(fā)現(xiàn)并闡明TNBC耐藥的分子機制，尋求新的治療靶標，有助于提高耐藥TNBC的療效，也是當前TNBC研究領域的重要方向。

肝細胞生長因子受體c-Met是原癌基因c-met的編碼產(chǎn)物，其與配體結合后，發(fā)生自身磷酸化，并進一步活化細胞內(nèi)多種不同的信號分子，經(jīng)過瀑布式的磷酸化反應，將外界信號逐漸放大，最終傳至細胞核內(nèi)，誘導細胞發(fā)生一系列反應，包括細胞增殖、運動、遷移和形態(tài)改變等。研究證實，其可以促進多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，包括乳腺癌[3]。此外，c-Met誘導腫瘤細胞耐藥的研究也多有報道。然而，對于c-Met促進TNBC細胞耐藥的研究尚未見相關報道。因此，本文將通過研究c-Met在TNBC細胞阿霉素耐藥中的作用及其相關機制，為其作為TNBC耐藥后治療的靶點提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗試劑

c-Met抗體、AKT抗體、磷酸化AKT(p-AKT)抗體、GAPDH抗體及c-Met-siRNA、AKT-siRNA購于Santa Cruz；熒光標記 II 抗購于Li-Cor Biosciences；Lipofectamine 2000轉染試劑購于Invitrogen；胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基均購于Gibco；阿霉素(adriamycin，ADR)購于Sigma；能表達穩(wěn)定活性c-Met蛋白的pBABE-puro TPR-Met質(zhì)粒(Addgene plasmid 10902)[4]由Addgene提供。

2 細胞培養(yǎng)及耐藥株構建

MDA-MB-231細胞系購于ATCC，使用含10%胎牛血清及100 mg/L青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在構建阿霉耐藥細胞株(MDA-MB-231/ADR)時，在培養(yǎng)基中加入終濃度為0.1 mg/L的阿霉素，10次傳代后收集存活細胞，并繼續(xù)在含有多柔比星的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少6個月的時間，以確保其耐藥性[5-6]。

3 主要實驗方法

3.1 siRNA及質(zhì)粒轉染 siRNA或質(zhì)粒轉染時，于6孔板中每孔接種105個細胞，加入2 mL培養(yǎng)基，當細胞密度達到80%～90%時使用Lipofectamine 2000作為轉染試劑，按試劑說明書進行實驗操作，并在轉染48 h后檢測轉染效率或用于下一步實驗。

3.2 實時熒光定量PCR 收集細胞加入Qiagen RLT裂解液，RNeasy mini kit (Qiagen)提取RNA，并使用M-MLV反轉錄酶進行反轉錄。實時熒光定量PCR使用SYBR Green I Master Mix 試劑盒及Light Cycler 480檢測系統(tǒng)(Roche)，GAPDH作為內(nèi)參照，設置陰性、陽性對照，每個樣本重復測量3次。使用引物序列如下：c-Met的上游引為5’-TCTTGGGACATCAGAGGGTC-3’，下游引物為5’-TGACTGCAGGACTGGAAATG-3’；GAPDH的上游引物為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’，下游引物為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

3.3 Western blotting實驗 收集細胞，RIPA緩沖液裂解細胞提取總蛋白并進行定量，行SDS-PAGE分離蛋白，計算50 ng蛋白溶液上樣體積，常規(guī)電泳、轉膜后孵育I抗及熒光標記的II抗，使用Odyssey 紅外成像系統(tǒng)(Li-Cor Biosciences)檢測膜上的熒光強度并進行分析。

3.4 MTT實驗 96孔板每孔接種5×103細胞，180 μL全培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h及96 h。去上清，加入180 μL PBS及20 μL濃度為5 g/L的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，棄上清加入DMSO 50 μL，室溫放置15 min后，振蕩混勻，用酶標儀于570 nm波長下測定吸光度值。實驗設置對照組和干擾組，每組細胞均做5復孔。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料使用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間差異的比較采用t檢驗。 以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 c-Met在MDA-MB-231細胞及MDA-MB-231/ADR細胞中的差異表達

MDA-MB-231/ADR細胞中c-Met的mRNA及蛋白表達均顯著高于對照的MDA-MB-231細胞(P<0.01)，見圖1。

2 c-Met促進MDA-MB-231細胞的增殖及阿霉素耐藥

利用pBABE-puro TPR-MET質(zhì)粒轉染乳腺癌細胞，使MDA-MB-231細胞高表達具有穩(wěn)定活性的c-Met蛋白(P<0.01)，見圖2。與未轉染或轉染空載體質(zhì)粒(MDA-MB-231/NC)的MDA-MB-231細胞相比，c-Met高表達的MDA-MB-231/c-Met細胞活力顯著增強(P<0.01)，見圖3。此外，在培養(yǎng)基中加入終濃度為0.1 mg/L的阿霉素72 h后，發(fā)現(xiàn)阿霉素可以有效抑制MDA-MB-231及MDA-MB-231/NC細胞的活力(P<0.05)，但對c-Met蛋白高表達的MDA-MB-231細胞影響較小，表明c-Met可以促進MDA-MB-231細胞對阿霉素的耐藥，見圖4。

Figure 1.The differential expression of c-Met in MDA-MB-231 cells and MDA-MB-231/ADR cells.Mean±SD. n=3～5. ** P<0.01 vs MDA-MB-231 cells.

3 抑制c-Met表達逆轉MDA-MB-231/ADR細胞的阿霉素耐藥

阿霉素不影響MDA-MB-231/ADR的細胞活力，但當利用c-Met-siRNA抑制MDA-MB-231/ADR中的c-Met后，阿霉素可顯著降低MDA-MB-231/ADR的細胞活力(P<0.05)，表明降低細胞中c-Met的表達可以逆轉乳腺癌細胞對阿霉素的耐藥，見圖5。

4 c-Met通過AKT信號介導MDA-MB-231細胞耐藥

AKT是HGF/c-Met信號途徑中一個重要的下游信號分子[7]，其可能也參與了c-Met對TNBC細胞耐藥的調(diào)控。為了驗證這個假設，我們首先觀察了c-Met對MDA-MB-231細胞中AKT表達或活性的影響，結果發(fā)現(xiàn)，轉染c-Met高表達質(zhì)粒的乳腺癌細胞中AKT的表達并未升高，但磷酸化的AKT水平顯著增加(P<0.01)，表明c-Met可以促進AKT的活化。此外，當共轉染AKT-siRNA及c-Met高表達質(zhì)粒后，MDA-MB-231細胞表現(xiàn)出與未干預細胞類似的阿霉素敏感性(P<0.05)，表明當AKT被抑制后，c-Met促MDA-MB-231細胞耐藥的能力減弱，見圖6。

Figure 2.The stable expression of c-Met protein in the TNBC cell line by transfection of the plasmid pBABE-puro TPR-Met. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs MDA-MB-231 cells and MDA-MB-231/NC cells.

Figure 3.Over-expression of c-Met increased the MDA-MB-231 cell activity. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs MDA-MB-231 cells and MDA-MB-231/NC cells.

Figure 4.The effects of c-Met on the doxorubicin induced inhibition of MDA-MB-231 cell activity. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs ADR.

Figure 5.Inhibition of c-Met reversed doxorubicin resistance of MDA-MB-231/ADR cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs ADR; **P<0.01 vs MDA-MB-231/ADR and control-siRNA.

討 論

c-Met在三陰性乳腺癌中的高表達已被多項研究證實[8-9]，然而對于其在耐藥細胞中的表達研究卻較少。大量研究表明，c-Met對腫瘤組織的生長、遷移和侵襲、腫瘤新生血管的形成均具有重要意義[3]。過去的幾十年中，c-Met被證實在乳腺癌組織中過表達，與其相關的信號通路與乳腺腫瘤的發(fā)展及預后密切相關[10]。在TNBC中，c-Met同樣能促進癌癥的惡化，并被認為可以作為TNBC的治療靶點[10]。在本實驗中，當在MDA-MB-231細胞中高表達c-Met蛋白時，細胞的增殖能力顯著提高，再次證實了c-Met具有促進TNBC進展的作用。受此啟發(fā)，多種人工設計的可溶性c-Met受體拮抗劑已被用于體外或體內(nèi)實驗，結果證實其能有效抑制TNBC的增殖及轉移[10]。如馮煒紅等[11]利用c-Met抑制劑SGX523作用于MDA-MB-231細胞，結果發(fā)現(xiàn)SGX523能明顯抑制乳腺癌細胞的增殖，SGX523處理MDA-MB-231細胞48 h后，可誘導乳腺癌細胞凋亡和細胞周期G0/G1期阻滯。這些結果為c-Met靶向治療的臨床轉化提供了良好的實驗及理論基礎。

Figure 6.c-Met induced doxorubicin resistance of MDA-MB-231 cells through AKT pathway. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs ADR; **P<0.01 vs MDA-MB-231 cells and MDA-MB-231/NC cells.

但值得注意的是，關于c-Met在TNBC細胞耐藥中的作用尚無相關研究。因此，本實驗以TNBC細胞系MDA-MB-231作為研究對象，通過增加或降低細胞中c-Met的表達來評價其在TNBC細胞阿霉素耐藥中的作用。結果發(fā)現(xiàn)，阿霉素耐藥細胞株中c-Met的表達升高，而在MDA-MB-231細胞中高表達c-Met蛋白可以降低癌細胞對阿霉素的敏感性；同時，抑制耐藥細胞株中c-Met的表達可以逆轉癌細胞對阿霉素的耐藥。這些結果與Que等[12]在骨髓瘤細胞中的發(fā)現(xiàn)一致，即抑制c-Met的表達可以提高腫瘤細胞對阿霉素化療的敏感性。此外，Shattuck等[13]還發(fā)現(xiàn)，c-Met能誘導HER2陽性乳腺癌對曲珠單抗的耐藥，再次證實c-Met與乳腺癌耐藥的相關性。因此，針對c-Met的靶向治療可以為腫瘤耐藥后的治療提供新的策略。

c-Met作為肝細胞生長因子受體促進乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程中，涉及多個信號通路，如與細胞存活相關的PI3K/AKT通路、增殖相關ERK/MAPK通路及轉移侵襲相關Crk/Rac通路[10,14]。而本研究發(fā)現(xiàn)，c-Met促進TNBC細胞阿霉素耐藥主要通過AKT信號分子，當AKT被抑制后，c-Met促MDA-MB-231細胞耐藥的能力明顯減弱。在此過程中值得注意的是，c-Met是一種具有絡氨酸激酶活性的蛋白，其信號轉導主要是通過磷酸化激活下游信號分子，如AKT等。在本實驗中，我們同樣觀察到c-Met可磷酸化激活AKT，而并不影響其表達量。該現(xiàn)象也在馮煒紅等[11]的研究中得以證實。

本實驗中僅應用了1個TNBC細胞系作為研究對象，c-Met及其相關分子信號的促阿霉素耐藥作用是否普遍存在于TNBC還需應用更多的細胞系來驗證，同時體內(nèi)實驗的完善能更進一步地確認c-Met的作用。其次，本研究僅僅評價了TNBC中c-Met與阿霉素耐藥之間的關系，對于TNBC以蒽環(huán)類及紫杉醇類為1線方案的其它藥物耐藥的研究也需要更多的實驗來加以證實。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)當初始細胞密度低于60%時，MTT的檢測結果與BrdU法的檢測結果具有較高的一致性，這與劉蘋等[15]的研究結果相似。本研究的MTT實驗結果在一定程度上也反映了細胞的增殖能力。對于這些結果，我們將在今后的研究進一步加以驗證。

[1] Poage GM, Hartman ZC, Brown PH. Revealing targeted therapeutic opportunities in triple-negative breast cancers: a new strategy[J]. Cell Cycle, 2013, 12(17):2705-2706.

[2] Crown J, O’Shaughnessy J, Gullo G. Emerging targeted therapies in triple-negative breast cancer[J]. Ann Oncol, 2012, 23(Suppl 6):vi56-vi65.

[3] Blumenschein GR Jr, Mills GB, Gonzalez-Angulo AM. Targeting the hepatocyte growth factor-cMET axis in can-cer therapy[J]. J Clin Oncol, 2012, 30(26):3287-3296.

[4] Gupta PB, Kuperwasser C, Brunet JP, et al. The melanocyte differentiation program predisposes to metastasis after neoplastic transformation[J]. Nat Genet, 2005, 37(10):1047-1054.

[5] Fang Y, Shen H, Cao Y, et al. Involvement of miR-30c in resistance to doxorubicin by regulating YWHAZ in breast cancer cells[J]. Braz J Med Biol Res, 2014, 47(1):60-69.

[6] Bao L, Hazari S, Mehra S, et al. Increased expression of P-glycoprotein and doxorubicin chemoresistance of metastatic breast cancer is regulated by miR-298[J]. Am J Pathol, 2012, 180(6):2490-2503.

[7] Usatyuk PV, Fu P, Mohan V, et al. Role of c-Met/phosphatidylinositol 3-kinase (PI3k)/Akt signaling in hepatocyte growth factor (HGF)-mediated lamellipodia formation, reactive oxygen species (ROS) generation, and motility of lung endothelial cells[J]. J Biol Chem, 2014, 289(19):13476-13491.

[8] Inanc M, Ozkan M, Karaca H, et al. Cytokeratin 5/6, c-Met expressions, and PTEN loss prognostic indicators in triple-negative breast cancer[J]. Med Oncol, 2014, 31(1):801.

[9] Raghav KP, Wang W, Liu S, et al. cMET and phospho-cMET protein levels in breast cancers and survival outcomes[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(8):2269-2277.

[10]Gastaldi S, Comoglio PM, Trusolino L. The Met oncogene and basal-like breast cancer: another culprit to watch out for?[J]. Breast Cancer Res, 2010, 12(4):208.

[11]馮煒紅，張 斌，趙洪猛，等. C-MET抑制劑SGX523誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞系的凋亡[J]. 中國腫瘤臨床, 2012, 39(2):61-64

[12]Que W, Chen J. Knockdown of c-Met inhibits cell proliferation and invasion and increases chemosensitivity to doxorubicin in human multiple myeloma U266 cellsinvitro[J]. Mol Med Rep, 2011, 4(2):343-349.

[13]Shattuck DL, Miller JK, Carraway KL 3rd, et al. Met receptor contributes to trastuzumab resistance of Her2-overexpressing breast cancer cells[J]. Cancer Res, 2008, 68(5):1471-1477.

[14]陸海英，劉克劍，張 悅，等. 中藥抗纖靈方含藥血清對TGF-β1刺激的HK-2細胞c-Met及其下游MAPK信號分子的調(diào)控作用[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(1):154-157.

[15]劉 蘋，李 平，熊仁平，等. MTT法與BrdU ELISA法檢測成纖維細胞增殖的可靠性比較[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2006, 28(11):1262-1263.

Effects of c-Met on proliferation of triple negative breast cancer and sensitivity to doxorubicin

DENG Zhi-ping1,2, LIAO He-he1, WANG Zhou-quan1, YANG Bo1, SONG Zhang-jun1, YAO Jun-tao1, REN Hong1, ZHANG Ming-xin3

(1TheSecondDepartmentofThoracicSurgery,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,2DepartmentofBreastDisease,TumorHospitalofShaanxi,Xi’an710061,China;3TangduHospitalofTheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710000,China.E-mail:lypdzp@163.com)

AIM: To investigate the effects of c-Met on the proliferation and the sensitivity to chemotherapeutic drugs of triple negative breast cancer cells. METHODS: Doxorubicin-resistant cells (MDA-MB-231/ADR) were established. The expression of c-Met at mRNA and protein levels in the MDA-MB-231/ADR cells and parental MDA-MB-231 cells was detected by real-time PCR and Western blotting. c-Met siRNA and plasmid or AKT siRNA were transfected into the cancer cells. The cell proliferation and the sensitivity to doxorubicin were determined by MTT assay. RESULTS: The expression of c-Met at mRNA and protein levels in MDA-MB-231/ADR cells was significantly higher than that in parental MDA-MB-231 cells. Transfection with pBABE-puro TPR-MET plasmid into the MDA-MB-231 cells induced cell proliferation and resistance to doxorubicin. Meanwhile, inhibition of c-Met in the MDA-MB-231/ADR cells by siRNA reversed the doxorubicin-resistance. In addition, over-expression of c-Met led to higher phosphorylation level of AKT, which was involved in the effects of c-Met on the MDA-MB-231 cell proliferation and doxorubicin-resistance. CONCLUSION: c-Met may have the potential as a therapeutic target in the treatment of triple negative breast cancer.

c-Met; Triple negative breast cancer; Cell proliferation; Doxorubicin; Drug resistantce

1000- 4718(2015)03- 0447- 05

2014- 10- 14

2014- 12- 05

國家自然科學基金資助項目(No. 81302055);陜西省自然科學基金資助項目(No. 2013JM4035)

△通訊作者 Tel: 029-85276159; E-mail:lypdzp@163.com

R363;R737.9

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.011