李 金， 黃 海， 賴義明， 曾樂祥， 曹 億， 王淦平， 陳賢舉， 余永晟， 陳杰青， 張思敏， 張一鳴， 郭正輝△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1泌尿外科， 2小兒外科， 3急診外科，廣東 廣州 510120； 4深圳市第二人民醫(yī)院泌尿外科，廣東 深圳 518035； 5惠州市中心醫(yī)院泌尿外科，廣東 惠州 516001； 6南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510282)

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沉默婆羅雙樹樣基因4對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖和凋亡生物學(xué)行為的影響*

李 金1， 黃 海1， 賴義明1， 曾樂祥2， 曹 億3， 王淦平1， 陳賢舉1， 余永晟1， 陳杰青4， 張思敏5， 張一鳴6， 郭正輝1△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1泌尿外科，2小兒外科，3急診外科，廣東 廣州 510120；4深圳市第二人民醫(yī)院泌尿外科，廣東 深圳 518035；5惠州市中心醫(yī)院泌尿外科，廣東 惠州 516001；6南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510282)

目的： 使用小干擾RNA(siRNA)抑制人前列腺癌LNCaP細(xì)胞中婆羅雙樹樣基因4(SALL4)的表達(dá)并對(duì)抑制效果進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)沉默(SALL4)后LNCaP細(xì)胞增殖、集落形成及凋亡等生物學(xué)行為的變化。方法: 培養(yǎng)LNCaP細(xì)胞，分為si-SALL4組、陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組。Real-time PCR與Western blotting技術(shù)檢測(cè)SALL4 mRNA與蛋白水平。采用MTS比色法觀察各組細(xì)胞增殖能力的變化，采用集落形成實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞集落形成能力的變化，流式細(xì)胞術(shù)研究SALL4對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，利用Western blotting方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)情況。結(jié)果: 與陰性對(duì)照組相比，si-SALL4組SALL4 mRNA和蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞集落形成能力均明顯降低(P<0.05)，而凋亡細(xì)胞明顯增加(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)減弱，而Bax的表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論: 通過siRNA技術(shù)沉默(SALL4)表達(dá)可抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖和集落形成能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其促進(jìn)凋亡作用可能與Bcl-2及Bax表達(dá)有關(guān)。

SALL4蛋白； 前列腺腫瘤； 細(xì)胞凋亡

前列腺癌是歐美國(guó)家診斷率最高的惡性腫瘤，居男性惡性腫瘤死亡率第2位，近年來隨著居民平均壽命的延長(zhǎng)和診斷水平的提高，我國(guó)的發(fā)病率也逐年上升[1]。前列腺癌早期無明顯癥狀，大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)腫瘤已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療效果欠佳，從而導(dǎo)致患者死亡率升高。因此，尋找能夠早期預(yù)測(cè)前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的特異性標(biāo)記物，及開發(fā)靶向此標(biāo)記物的抑制藥物很有必要。

婆羅雙樹基因4(Sal-like 4，SALL4)最早于 2006年克隆于果蠅，編碼的蛋白具有多個(gè) C2H2 型的雙鋅指結(jié)構(gòu)，是一種廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。在正常生理狀態(tài)下，SALL4 作為一種胚胎干細(xì)胞因子，在胚胎的發(fā)育和器官形成的過程中發(fā)揮重要作用[2]。近年來研究表明其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)。SALL4 高表達(dá)的報(bào)道可見于生殖細(xì)胞腫瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌和肝癌等[3-7]。我們的前期研究[8]中發(fā)現(xiàn)SALL4蛋白在前列腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與Gleason評(píng)分、前列腺癌臨床分期、預(yù)后及組織前列腺特異抗原表達(dá)密切相關(guān)，提示SALL4蛋白可能成為未來前列腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估的重要標(biāo)記物。因此需要對(duì)其在前列腺癌中的生物學(xué)功能進(jìn)行深入的研究。本研究利用RNAi技術(shù)沉默前列腺癌LNCaP細(xì)胞株中SALL4基因表達(dá)，并通過MTS檢測(cè)增殖、集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)集落形成能力、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡情況，來探討SALL4蛋白在調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和前列腺癌細(xì)胞系

RNAiso Plus總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑購自TaKaRa；SALL4兔抗人多克隆抗體購自Abcam；Bcl-2單克隆抗體購自CST；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；MTS試劑購于Promega；凋亡試劑購于eBioscience；血清購自Biological Industries；RPMI-1640不完全培養(yǎng)基購自Gibco；其它試劑購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

人前列腺癌LNCaP細(xì)胞系由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院林百欣醫(yī)學(xué)研究中心提供。LNCaP細(xì)胞在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含有10%小牛血清的RPMI-1640。

2 方法

2.1 LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h，將LNCaP細(xì)胞按2×109/m2的密度接種至6孔板。待細(xì)胞匯合至70%～80%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分為3組：空白對(duì)照組不做任何處理(blank control)，陰性對(duì)照組(negative control)加入陰性對(duì)照siRNA(NC-siRNA)。si-SALL4組加入SALL4siRNA。脂質(zhì)體lipofectamineTM2000按照5 mL/L溶于無血清無抗生素培養(yǎng)基中，混勻。將各組siRNA按100 pmol/L的濃度溶于無血清無抗生素培養(yǎng)基中。將上述2種混合液混合，室溫放置20 min。棄舊培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，然后將脂質(zhì)體和RNA混合物加入細(xì)胞中，補(bǔ)足培養(yǎng)基。6 h后換正常含血清培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

2.2 Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞的SALL4 mRNA水平 轉(zhuǎn)染48 h后，利用Trizol試劑提取LNCaP細(xì)胞的總RNA，real-time PCR擴(kuò)增SALL4和內(nèi)參照GAPDH。SALL4引物正義鏈為5’-CCCGGCAGTAAGGACTGTC-3’，反義鏈為5’-TCTCTGTCTTTAGGTACACCACA-3’，PCR產(chǎn)物為97 bp；GAPDH引物正義鏈為5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，反義鏈為5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為500 bp。PCR反應(yīng)條件為98 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共32個(gè)循環(huán)。

2.3 Western blotting分析細(xì)胞SALL4、Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞提取總蛋白并定量，取50 μg蛋白進(jìn)行8%SDS-PAGE分離蛋白，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，孵育GAPDH(1∶1 000)、SALL4(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)和Bax(1∶1 000)Ⅰ抗4 ℃過夜。TBST洗膜，加入1∶2 000稀釋的羊抗兔IgG/HRP，室溫孵育1 h，TBST洗膜，然后用超敏ECL發(fā)光液(Millipore)發(fā)光。

2.4 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 將LNCaP細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板,轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h、96 h后，各孔分別加入20 μL MTS試劑，37 ℃培養(yǎng)4 h，在490 nm處檢測(cè)吸光度值(A)。每組設(shè)置3復(fù)孔，最終結(jié)果取3孔平均值。

2.5 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成率 將LNCaP細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，轉(zhuǎn)染24 h后重新消化貼壁細(xì)胞，將消化下的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組各取2 000個(gè)細(xì)胞重新種于6孔板，待14 d后移除培養(yǎng)基，用1 mL多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，吸去多聚甲醛，加入1 mL結(jié)晶紫染液染色30 min，移去結(jié)晶紫用純水清洗干凈，37 ℃下晾干后在鏡下計(jì)數(shù)，大于50個(gè)細(xì)胞記為1個(gè)集落。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染后72 h收集106個(gè)細(xì)胞，用PBS洗滌，1 000 r/min離心5 min，反復(fù)2次。棄上清液，收集細(xì)胞，混勻沉淀，加入500 μL binding buffer懸浮細(xì)胞，加入10 μL PI，混勻；室溫、避光，反應(yīng)5～15 min；5 μL Annexin V-FITC混勻后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行各組間差異的比較。

結(jié) 果

1 siRNA抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞中SALL4 mRNA水平

轉(zhuǎn)染后48 h提取細(xì)胞總RNA，利用real-time PCR方法檢測(cè)SALL4基因轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖1A所示。設(shè)定陰性對(duì)照組的SALL4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為100%，si-SALL4實(shí)驗(yàn)組的SALL4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為39.8%(P<0.05)，si-SALL4在mRNA水平上抑制了SALL4的表達(dá)。

2 siRNA抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞中SALL4蛋白水平

轉(zhuǎn)染72 h后提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果如圖1B所示。si-SALL4實(shí)驗(yàn)組的SALL4蛋白水平為對(duì)照組的49.5%，蛋白表達(dá)受到明顯抑制(P<0.05)。Western blotting結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了構(gòu)建的SALL4小干擾RNA可在蛋白水平上抑制SALL4表達(dá)。

Figure 1.The expression of SALL4 at mRNA (A) and protein (B) levels in LNCaP cells after transfection with SALL4 siRNA. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs negative control.

3 轉(zhuǎn)染SALL4小干擾RNA抑制細(xì)胞增殖

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比轉(zhuǎn)染si-SALL4后72 h LNCaP細(xì)胞的增殖活性開始受到抑制(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.MTS detection results after SALL4 siRNA transfection in LNCaP cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs negative control.

4 轉(zhuǎn)染SALL4小干擾RNA抑制細(xì)胞集落形成

轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行集落實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)14 d后檢測(cè)集落形成率。轉(zhuǎn)染SALL4 siRNA后，LNCaP細(xì)胞的集落形成數(shù)與陰性對(duì)照組相比下降了46.4%(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.Colony formation results after SALL4 siRNA transfection in LNCaP cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs negative control.

5 Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

si-SALL4組出現(xiàn)早期凋亡細(xì)胞群，其總體凋亡率為15.46%，與陰性對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.Detection of apoptotic rate by flow cytometry after transfection of SALL4 siRNA in LNCaP cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs negative control.

6 si-SALL4下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，si-SALL4組中LNCaP細(xì)胞的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖5。

討 論

在歐美國(guó)家，前列腺癌是一種老年男性常見疾病，其發(fā)病率僅次于肺癌，居第2位。流行病學(xué)顯示，前列腺癌在我國(guó)的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)，已列為男性泌尿系統(tǒng)腫瘤的第3位[9]，但發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究表明，腫瘤不受控制的增殖能力與抵抗細(xì)胞凋亡能力是惡性腫瘤的兩大標(biāo)志之一[10]，但是調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與抗凋亡功能的機(jī)制尚未明確。

Figure 5.The effect of SALL4 siRNA on the expression of Bax and Bcl-2 proteins in LNCaP cells. Mean±SD. n=3. *P <0.05 vs negative control.

SALL4基因在維持胚胎器官的分化與發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子和干性因子。在人類中，SALL4的缺失或突變與多種疾病相關(guān)，包括acro-renal-ocular 綜合征、Okihiro綜合征和IVIC綜合征，這些疾病均以多器官畸形為特征，如耳畸形、聽力喪失以及腎臟、心臟和肢體等臟器的缺陷等。近年來研究表明SALL4蛋白在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，其功能可能在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞特別是腫瘤干細(xì)胞的增殖與凋亡當(dāng)中發(fā)揮著重要的作用。SALL4過表達(dá)于不同的惡性腫瘤，在結(jié)直腸癌中，大約90%的腫瘤標(biāo)本有SALL4過表達(dá)，并且與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度密切相關(guān)[11]，在乳腺癌中也有86.1%的腫瘤SALL4表達(dá)增高，甚至在腫瘤的早期就可以增高[6]。 此外，Oikawa等[12]的研究指出，SALL4在肝癌干細(xì)胞中而非肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，干預(yù)SALL4基因的表達(dá)后，肝癌干細(xì)胞的增殖能力下調(diào)，凋亡增加。Yang等[13]發(fā)現(xiàn)，從白血病NB4細(xì)胞系分離出的癌干細(xì)胞中SALL4的表達(dá)對(duì)與細(xì)胞的存活與凋亡至關(guān)重要，表達(dá)譜芯片顯示抑制SALL4基因后抗凋亡基因bcl-2等下調(diào)明顯，而TP53、TNF等促凋亡基因顯著上調(diào)，提示SALL4對(duì)于維持白血病細(xì)胞抗凋亡能力至關(guān)重要。另外，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，前列腺特異性膜抗原可能通過上調(diào)ERK蛋白的活性正向調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移[14]，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不同情況下ERK與SALL4的表達(dá)具有高度的一致性，磷酸化的ERK可能通過進(jìn)入胞內(nèi)激活SALL4啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞快速增殖機(jī)制，因此前列腺癌中SALL4的高表達(dá)可能受前列腺特異性膜抗原調(diào)控。我們的前期研究[8]中發(fā)現(xiàn)SALL4蛋白在前列腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與Gleason評(píng)分、前列腺癌臨床分期、預(yù)后及組織前列腺特異抗原表達(dá)密切相關(guān)，提示其可能是前列腺癌發(fā)生發(fā)展的重要標(biāo)記物。但是目前SALL4調(diào)控前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的研究尚未見報(bào)道。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)，抑制SALL4蛋白表達(dá)后，前列腺癌LNCAP細(xì)胞的增殖和集落形成能力明顯降低，凋亡細(xì)胞增加，提示抑制SALL4可能通過增加細(xì)胞凋亡來抑制細(xì)胞增殖。但是相關(guān)機(jī)制尚未明確。

細(xì)胞的凋亡受多種因素的影響，是一個(gè)涉及多分子、多基因水平變化的多階段過程，在其過程中不同功能的分子和基因?qū)?xì)胞所產(chǎn)生的影響協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[15]。眾多研究表明bcl-2基因是抗細(xì)胞凋亡的重要基因，其過度表達(dá)可導(dǎo)致下游產(chǎn)物Bax的減少，抑制細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致細(xì)胞增殖與程序性細(xì)胞死亡失衡[16-17]。而且近年研究也發(fā)現(xiàn)Bcl-2在進(jìn)展及轉(zhuǎn)移性前列腺癌中高表達(dá)，其可導(dǎo)致前列腺癌抗凋亡能力增加，并最終導(dǎo)致腫瘤的耐藥性增加[18-19]。本實(shí)驗(yàn)中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SALL4 siRNA后，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Bcl-2的蛋白水平下降，Bax的蛋白水平上升，說明抑制SALL4具有促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡的重要作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與Bax的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SALL4可以調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，下調(diào)SALL4可導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞增殖減少、集落形成能力下調(diào)，凋亡增加，其機(jī)制可能是通過Bcl-2與Bax蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡。此結(jié)果為進(jìn)一步研究SALL4調(diào)控細(xì)胞的機(jī)制及其在前列腺癌中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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Knockdown of SALL4 expression regulates cell proliferation and apoptosis in prostate cancer LNCaP cells

LI Jin1, HUANG Hai1, LAI Yi-ming1, ZENG Le-xiang2, CAO Yi3, WANG Gan-ping1, CHEN Xian-ju1, YU Yong-sheng1, CHEN Jie-qing4, ZHANG Si-min5, ZHANG Yi-ming6, GUO Zheng-hui1

(1DepartmentofUrology，2DepartmentofPediatricSurgery，3DepartmentofEmergencySurgery,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;4DepartmentofUrology,ShenzhenSecondMunicipalHospital,Shenzhen518035,China;5DepartmentofUrology,HuizhouMunicipalCentralHospital,Huizhou516001,China；6DepartmentofUrology，ZhujiangHospital，SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510282，China.E-mail: 2352236171@qq.com)

AIM: To investigate the SALL4 expression, proliferation and apoptosis in the LNCaP cells after transfection ofSALL4 siRNA. METHODS: The expression of SALL4 at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blotting. MTS assay, colony formation assay and flow cytometry were used to determine the proliferation, colony formation ability and apoptosis of the LNCaP cells. The effect of SALL4 on the expression of Bax and Bcl-2 was analyzed by Western blotting. RESULTS: Compared with negative control group, the expression of SALL4 at mRNA and protein levels in LNCaP cells was down-regulated by transfection ofSALL4 siRNA (P<0.05). The proliferation rate and colony formation ability were decreased, while apoptosis rate increased in si-SALL4 group (P<0.05). Higher expression of Bax and lower expression of Bcl-2 in si-SALL4 group were observed (P<0.05). CONCLUSION: Down-regulation ofSALL4 by siRNA not only suppresses LNCaP cell proliferation and colony formation, but also inhibits Bcl-2 expression and activates Bax expression to induce apoptosis.

SALL4 protein; Prostate neoplasms; Apoptosis

1000- 4718(2015)03- 0435- 05

2014- 10- 27

2014- 12- 12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81272807； No. 81472382； No. 81101947)； 廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. S2011010004546； No. S2012010010780)

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R730.23

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.009