王曉東， 陳美苑， 曾 志， 周卓妍△， 楊 默

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科， 2醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，廣東 廣州 510632； 3廣東藥學(xué)院生理學(xué)系，廣東 廣州 510006； 4南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510515)

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促血小板生成素對(duì)化學(xué)性缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響*

王曉東1， 陳美苑2， 曾 志3， 周卓妍2△， 楊 默4

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，2醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，廣東 廣州 510632；3廣東藥學(xué)院生理學(xué)系，廣東 廣州 510006；4南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510515)

目的： 研究促血小板生成素(TPO)對(duì)化學(xué)性缺氧誘導(dǎo)的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞凋亡的影響及保護(hù)作用。方法: 將PC12細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)處理，分為對(duì)照組、氯化鈷(CoCl2)處理組、CoCl2+TPO組及TPO對(duì)照組。檢測各組PC12細(xì)胞的存活率并用Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞凋亡率，線粒體膜電位的變化及細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的變化。結(jié)果: 化學(xué)性缺氧模擬劑CoCl2可以明顯抑制PC12細(xì)胞的生長(P<0.01)；與對(duì)照組比較，CoCl2組的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，而CoCl2+TPO組的細(xì)胞凋亡率顯著低于CoCl2組(P<0.05)；TPO能減少細(xì)胞內(nèi)活性氧簇生成以及抑制細(xì)胞線粒體膜電位的降低(P<0.01)。結(jié)論: TPO能對(duì)抗CoCl2缺氧所致的細(xì)胞凋亡，穩(wěn)定線粒體膜電位，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

促血小板生成素； 氯化鈷； PC12細(xì)胞； 細(xì)胞缺氧； 細(xì)胞凋亡

缺血缺氧性腦損傷 (hypoxic-ischemic brain da-mage, HIBD)是臨床常見的多種疾病的共同表現(xiàn)。嚴(yán)重的缺血缺氧可致神經(jīng)元壞死，較輕的缺血缺氧則可通過凋亡途徑造成神經(jīng)元遲發(fā)性死亡，此反應(yīng)在致病因素清除后仍可持續(xù)數(shù)天甚至數(shù)周。缺血缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的病理生理機(jī)制很復(fù)雜，包括神經(jīng)細(xì)胞能量代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成增加、線粒體能量供應(yīng)受阻、線粒體的損傷和細(xì)胞內(nèi)鈣超載等，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元遲發(fā)性死亡。

促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)是體內(nèi)重要的造血生長因子。以往的研究一直認(rèn)為TPO的功能僅限于在造血系統(tǒng)，近年的深入研究發(fā)現(xiàn)其在造血系統(tǒng)以外也有作用。Yang等[1]首次證實(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在有TPO受體c-Mpl的表達(dá)。還發(fā)現(xiàn)TPO有促進(jìn)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞株C17.2增殖和抗凋亡的作用[2]。本課題的前期研究中發(fā)現(xiàn)在新生大鼠缺血缺氧腦損傷模型中，早期使用TPO干預(yù)可對(duì)缺血缺氧性腦損傷造成的新生大鼠腦功能障礙起到改善作用，但機(jī)制不明[3]。本研究采用化學(xué)性缺氧模擬劑氯化鈷(cobalt chloride，CoCl2)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞缺氧，觀察TPO對(duì)PC12細(xì)胞凋亡和線粒體膜電位的影響，為進(jìn)一步探討TPO在缺氧損傷的神經(jīng)細(xì)胞中的保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和主要試劑

大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12由廣州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室惠贈(zèng)。PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、飽和濕度、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用0.25%胰酶每2～3 d傳代1次，第3代開始用于實(shí)驗(yàn)。

RPMI-1640液體培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清購自杭州天杭生物科技公司；TPO由沈陽三生生物制藥有限公司惠贈(zèng)；CoCl2、胰蛋白酶、EDTA、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)和MTT均購自Sigma；青霉素和鏈霉素購自ICN Biomedicals；Annexin V/PI試劑盒、DCFH-DA和JC-1試劑盒購自凱基生物；PBS購自HyClone；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 建立CoCl2損傷及TPO保護(hù)模型 根據(jù)CoCl2處理濃度(200、400、600、800、1 000 μmol/L)將PC12細(xì)胞共分為5組，每組處理時(shí)間為24 h。然后分別檢測CoCl2對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響，確定合適的損傷濃度。之后，根據(jù)TPO保護(hù)濃度將PC12細(xì)胞分為25、50、100、200、400 μg/L TPO+CoCl2損傷組，每組處理48 h后檢測TPO對(duì)CoCl2抑制PC12細(xì)胞存活率的影響，確定TPO保護(hù)的最佳濃度。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)分組如下：(1)對(duì)照(control)組：用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)，不加任何處理因素; (2)CoCl2組：加入500 μmol/L CoCl2到上述培養(yǎng)液中培養(yǎng)PC12細(xì)胞24 h；(3)CoCl2+TPO組：先加入500 μmol/L CoCl2處理PC12細(xì)胞24 h后，換成加入100 μg/L TPO培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)PC12細(xì)胞48 h；(4)TPO組：于上述培養(yǎng)液中加入100 μg/L TPO培養(yǎng)PC12細(xì)胞48 h。

2.3 MTT法檢測細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96孔板培養(yǎng)過夜后，更換為含有不同處理因素的培養(yǎng)基，處理結(jié)束后各組細(xì)胞分別加入MTT(5 g/L)20 μL，37 ℃溫箱孵育3～4 h，離心棄上清，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃溫箱孵育10 min后用酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度(A)值(490 nm)，按公式：細(xì)胞存活率(%)=處理組A值/對(duì)照組A值×100%，求出各組的存活率，重復(fù)3次。計(jì)算并評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率。

2.4 AnnexinⅤ/PI雙染法測定細(xì)胞凋亡率 各組細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組要求給予不同的因素處理后，離心收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗2次，離心棄上清，用100 μL 1× AnnexinⅤ binding buffer重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)，取100 μL于試管中，加入5 μL的Annexin V-FITC和1 μL 100 mg/L的PI工作液，室溫避光反應(yīng)15 min后加入400 μL的1×Annexin V binding buffer輕輕混勻，用流式細(xì)胞儀(Coulter)檢測細(xì)胞的凋亡率。激發(fā)波長488 nm; 發(fā)射波長530 nm。每次檢測均使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞作為對(duì)照，進(jìn)行熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)。

2.5 線粒體膜電位測定 各組細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求給予不同的因素處理后，離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次收集不多于1×106的細(xì)胞；取1× incubation buffer，混勻并預(yù)熱至37 ℃；取500 μL的1× incubation buffer加入1 μL的JC-1，漩渦混勻配成JC-1工作液；取500 μL的JC-1工作液將細(xì)胞均勻懸浮，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15～20 min；室溫離心(2 000 r/min，5 min)收集細(xì)胞，用1× incubation buffer洗2次；吸取500 μL的1×incubation buffer重新懸浮細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞作為陰性對(duì)照組和經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的凋亡細(xì)胞作為陽性對(duì)照組，進(jìn)行熒光補(bǔ)償和設(shè)門調(diào)節(jié)。設(shè)定細(xì)胞取樣數(shù)為10 000個(gè)，Cell Quest軟件分析結(jié)果。同時(shí)取上述處理好的細(xì)胞在熒光顯微鏡(Nikon)下觀察拍照記錄結(jié)果。

2.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧簇水平測定 將PC12細(xì)胞接種于6孔板后按照實(shí)驗(yàn)要求給予不同的因素處理，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液清洗2次。按照1∶1 000比例用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，用無血清培養(yǎng)液充分清洗3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，采用熒光顯微鏡(Nikon)觀察、拍攝。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的方式表示。利用SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)；組間數(shù)據(jù)的兩兩比較采用Student-Newman-Keulsq檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度CoCl2損傷對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用

在培養(yǎng)液中加入不同濃度的CoCl2(0、200、400、600、800、1 000 μmol/L)作用于PC12細(xì)胞24 h， MTT檢測結(jié)果顯示，CoCl2劑量依賴性地降低PC12細(xì)胞存活率。隨著CoCl2作用濃度的逐漸增大，可以引起PC12細(xì)胞存活率明顯降低，且呈明顯的量效關(guān)系(P<0.01)。600 μmol/L CoCl2作用PC12細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率下降，而400 μmol/L CoCl2所引起PC12細(xì)胞存活率偏高，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇中間值500 μmol/L濃度的CoCl2作為損傷濃度，見圖1A。

2 不同濃度TPO對(duì)抗CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性

為觀察TPO對(duì)抗CoCl2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞毒性的作用，應(yīng)用500 μmol/L濃度的CoCl2處理PC12細(xì)胞后，在培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的TPO(25、50、100、200、400 μg/L)作用48 h，觀察TPO處理后對(duì)細(xì)胞存活率的影響。MTT檢測結(jié)果顯示，在25～100 μg/L的濃度范圍內(nèi)，TPO呈濃度依賴性地抑制CoCl2引起的細(xì)胞毒性作用，其中100 μg/L的TPO保護(hù)作用達(dá)到峰值(P<0.01)，隨著TPO濃度的升高，其保護(hù)效果逐漸減小。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇100 μg/L的TPO作用48 h作為對(duì)抗CoCl2抑制PC12細(xì)胞生長的保護(hù)模型，見圖1B。

Figure 1.The effect of different concentrations of CoCl2 on the viability of PC12 cells (A) and the protective effect of different concentrations of TPO on the viability of PC12 cells after CoCl2 treatment (B). Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05 vs 500 μmol/L CoCl2+0 μg/L TPO.

3 AnnexinⅤ/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率

用Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測各組不同處理的PC12細(xì)胞的凋亡情況，對(duì)照組和TPO組的凋亡率分別為6.13%和4.57%，CoCl2處理組的凋亡率顯著增加，達(dá)到23.06%(P<0.05)，CoCl2處理后再加用100 μg/L TPO 處理，其細(xì)胞凋亡率明顯降低至9.32%(P<0.05)，而100 μg/L的TPO本身不會(huì)引起PC12細(xì)胞的凋亡率改變，表明TPO有明顯的抗CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，見圖2。

Figure 2.The effect of TPO on the CoCl2 induced apoptosis of PC12 cells by flow cytometry. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs CoCl2 group.

4 線粒體膜電位的改變

采用JC-1熒光染色法觀察PC12細(xì)胞線粒體膜電位可見，對(duì)照組的PC12細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察到為紅色； TPO組也為紅色；CoCl2組在熒光顯微鏡下觀察到的PC12細(xì)胞為綠色； CoCl2+TPO 組PC12細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察呈橙色。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位的變化。結(jié)果表明，PC12細(xì)胞在500 μmol/L CoCl2作用24 h后可見線粒體膜電位下降，比對(duì)照組及TPO組明顯降低(P<0.01)，TPO+ CoCl2能明顯抑制CoCl2引起的線粒體膜電位降低(P<0.01)，提示TPO對(duì)CoCl2引起的線粒體膜電位降低有抑制作用，見圖3。

Figure 3.The effect of TPO on CoCl2-induced decrease in MMP in the PC12 cells. A: the images of JC-1 staining; B: the images of flow cytometry; C: quantitative analysis of the data of flow cytometry. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control group; ## P<0.01 vs CoCl2 group.

5 不同處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇變化的影響

利用DCFH-DA檢測PC12細(xì)胞內(nèi)ROS的變化情況可見，ROS含量會(huì)隨著胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)而增多。結(jié)果表明，PC12細(xì)胞在500 μmol/L CoCl2作用6 h后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)與正常組比較細(xì)胞內(nèi)熒光明顯增強(qiáng)；而TPO+CoCl2組能降低CoCl2引起的細(xì)胞內(nèi)ROS的生成(熒光明顯減弱)，而TPO單獨(dú)作用不會(huì)引起胞內(nèi)ROS水平的變化，見圖4。

討 論

TPO是重要的促血小板生成的造血生長因子，其蛋白結(jié)構(gòu)和基因序列與促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)有23%的同源性，與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)有36%的高度同源性。目前已有大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)EPO對(duì)神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用[4]。我們課題組在過往的研究中也證實(shí)EPO有良好的神經(jīng)保護(hù)作用，能穩(wěn)定神經(jīng)元胞膜，減少神經(jīng)元的壞死和抗細(xì)胞凋亡[5]。TPO是否也具有相似的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)功能？其作用機(jī)制是什么？研究表明TPO在體內(nèi)與其受體(c-Mpl)結(jié)合后可通過數(shù)條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如JAK-STAT通路、 MAPK通路和PI3K/Akt 通路)來調(diào)節(jié)和影響細(xì)胞的增殖、成熟和凋亡。而體內(nèi)多種細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)存在c-Mpl，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)各部位中已證明有c-Mpl的廣泛表達(dá)[2，6]，體外研究表明TPO可以通過激活PI3K/Akt 這一通路來對(duì)抗無血清誘導(dǎo)C17.2細(xì)胞株的凋亡和促進(jìn)細(xì)胞生長，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[7-8]。本課題組也在新生大鼠缺血缺氧腦損傷模型的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在缺血缺氧早期使用TPO可以對(duì)缺血缺氧性腦損傷造成新生大鼠腦功能障礙起到治療和改善作用，減輕缺血缺氧對(duì)腦部發(fā)育的影響[3]。另有研究也發(fā)現(xiàn)在大腦中動(dòng)脈梗塞的成年大鼠模型中，TPO可明顯減小皮層梗塞面積，改善感覺-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能[9]。

Figure 4.The inhibitory effect of TPO on CoCl2 -induced increase in intracellular reactive oxygen species (ROS) in the PC12 cells (DCFH-DA staining, ×200).

CoCl2是一種化學(xué)性低氧模擬劑，在體外培養(yǎng)的多種細(xì)胞中能模擬低氧/缺血狀況，CoCl2可增加細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[10-11]。本研究結(jié)果也表明加入500 μmol/L CoCl2培養(yǎng)PC12細(xì)胞24 h后，該組細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加，線粒體膜電位降低，出現(xiàn)凋亡的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，與上述報(bào)道相符。目前研究認(rèn)為，CoCl2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷與絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路有關(guān)，該家族成員有p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)等。該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞轉(zhuǎn)化及凋亡等過程中具有至關(guān)重要的作用。有研究表明，化學(xué)性缺氧引起的神經(jīng)元損傷由p38 MAPK通路介導(dǎo)[10]，JNK通路活化也參與化學(xué)性缺氧引起的神經(jīng)損傷[11]，研究發(fā)現(xiàn)CoCl2能上調(diào)PC12細(xì)胞磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)，而ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理1 h可明顯拮抗CoCl2對(duì)p-ERK1/2表達(dá)的上調(diào)作用，提示CoCl2可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的大量堆積，ROS進(jìn)而參與CoCl2對(duì)PC12細(xì)胞ERK1/2通路的激活作用。ERK1/2通路活化是化學(xué)性低氧劑(CoCl2)引起的細(xì)胞毒性、線粒體損傷及致凋亡作用的可能機(jī)制，并與p38MAPK通路存在相互激活的協(xié)同作用[12]。在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠原代皮層神經(jīng)元凋亡的研究中也發(fā)現(xiàn)JNK蛋白磷酸化水平的升高與神經(jīng)元凋亡率升高有關(guān)[13]。本研究結(jié)果表明，TPO能減輕CoCl2對(duì)PC12細(xì)胞的損傷作用，在先加入500 μmol/L CoCl2處理PC12細(xì)胞24h后，換成加入100 μg/L TPO培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)PC12細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)該組細(xì)胞存活率上升，細(xì)胞內(nèi)ROS生成減少，線粒體膜電位降低減少，出現(xiàn)凋亡的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，該結(jié)果提示TPO對(duì)抗CoCl2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的作用機(jī)制可能與其在與受體(c-Mpl)結(jié)合后通過MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的效應(yīng)有關(guān)，推測TPO能抑制p38MAPK通路，抑制JNK蛋白磷酸化，使ERK1/2通路去活化，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

神經(jīng)細(xì)胞能量幾乎完全來源于線粒體氧化磷酸化供能，故其對(duì)缺血缺氧極其敏感。線粒體跨膜電位的維持是其功能得以正常進(jìn)行的前提條件。而線粒體內(nèi)、外膜交界處的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔可受多種細(xì)胞死亡信號(hào)如 Ca2+超載、氧化應(yīng)激等的作用而開放[14]，使線粒體膜電位無法維持，呼吸鏈斷裂。線粒體膜通透性的改變還能使線粒體基質(zhì)Ca2+釋放，促凋亡因子(如細(xì)胞色素C)外漏到胞漿，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡蛋白酶依賴及非凋亡蛋白依賴細(xì)胞凋亡途徑，引起細(xì)胞凋亡和死亡[15]。本研究結(jié)果顯示：采用JC-1熒光染色法觀察PC12細(xì)胞線粒體膜電位可見，對(duì)照組和TPO組的PC12細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察到均為紅色；表明這2組細(xì)胞線粒體膜電位水平較高，此時(shí)JC-1熒光染料形成聚合物，發(fā)出紅色的熒光；而 CoCl2組在熒光顯微鏡下觀察到的PC12細(xì)胞為綠色；表明CoCl2導(dǎo)致該組細(xì)胞線粒體膜電位水平降低，JC-1熒光染料以單體形式存在，發(fā)出綠色的熒光；在CoCl2+TPO 組PC12細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察呈橙色，表明TPO能明顯改善該組細(xì)胞線粒體膜電位的丟失，JC-1熒光染料大部分以聚合體形式存在，少數(shù)以單體形式存在，發(fā)出橙色的熒光。線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)出現(xiàn)之前，一旦線粒體膜電位不能維持，則細(xì)胞凋亡就不可逆轉(zhuǎn)。而TPO在與其受體(c-Mpl)結(jié)合后可通過數(shù)條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如JAK-STAT通路、 MAPK通路和PI3K/Akt 通路)來調(diào)節(jié)和改變下游信號(hào)分子的活性，穩(wěn)定線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔，維持線粒體膜的通透性，進(jìn)而維持線粒體膜電位的穩(wěn)定，減少線粒體釋放促凋亡因子來對(duì)抗CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。

TPO在促血小板生成等造血系統(tǒng)外表現(xiàn)出的神經(jīng)保護(hù)作用，表明其作用的多樣性，不可忽視。在腦出血和腦血管意外等疾病的治療中，TPO可能是比EPO副作用更小、更有效的治療藥物。進(jìn)一步研究TPO神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制和有效劑量，對(duì)臨床上缺血缺氧性腦損傷治療有重要的意義。

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Effect of thrombopoietin on chemical hypoxia-induced apoptosis of PC12 cells

WANG Xiao-dong1, CHEN Mei-yuan2, ZENG Zhi3, ZHOU Zhuo-yan2, YANG Mo4

(1DepartmentofNeurosurgery,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPhysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3DepartmentofPhysiology,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;4DepartmentofHematology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:zhuoyanzhou@126.com)

AIM: To study the effect of thrombopoietin (TPO) on chemical hypoxia-induced apoptosis of theRattusnorvegicusadrenal pheochromocytoma (PC12) cells. METHODS: The cultured PC12 cells were randomly divided into normal control group, cobalt chloride (CoCl2) group, CoCl2+TPO group and TPO group. The cell viability was mea-sured by MTT assay. The effect of TPO on CoCl2-induced cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V/PI double staining. The intracellular reactive oxygen species (ROS) were detected by fluorescence microscopy, and the changes of the mitochondrial membrane potential (MMT) were determined by flow cytometry and fluorescence microscopy. RESULTS: Chemical oxygen agent CoCl2significantly inhibited the growth of PC12 cells (P<0.01). The apoptotic rate in CoCl2group was obviously higher than that in control group (P<0.05), while the apoptotic rate in CoCl2+TPO group was obviously lower than that in CoCl2group (P<0.05). TPO decreased the production of ROS, and inhibited the decrease in MMP induced by CoCl2(P<0.01). CONCLUSION: TPO has a protective effect against CoCl2-induced apoptosis of PC12 cells by decreasing the production of ROS and inhibiting the decrease in MMP.

Thrombopoietin; Cobalt chloride; PC12 cells; Cell hypoxia; Cell apoptosis

1000- 4718(2015)03- 0409- 06

2014- 10 -22

2015- 01- 26

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81270580)

△通訊作者 Tel: 020-85220260; E-mail: zhuoyanzhou@126.com

R363.2； R338.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.005