陳雨龍，姚勤

（青島大學附屬醫(yī)院婦科，山東 青島 266500）

卵巢癌病死率居于婦科惡性腫瘤首位，其遠期生存率低。已有研究證實，癌細胞從瘤體脫落并獲得轉(zhuǎn)移種植能力的過程中，上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）起到了重要的作用［1］。微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，在卵巢癌中已發(fā)現(xiàn)多種miRNA可通過調(diào)節(jié)EMT影響卵巢癌的生物學特性。研究miRNA調(diào)節(jié)EMT影響卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中的分子機制，針對關鍵通路中的主要信號分子設計轉(zhuǎn)移篩查方法和靶向治療藥物，將為卵巢癌的預后判斷和治療提供新的思路。

1 miRNA及EMT概述

miRNA是一種長度為20～25個核苷酸的非編碼RNA分子。自LEE等［2］從線蟲克隆出lin－4基因以來，人類對miRNA的研究快速發(fā)展，據(jù)miRNA數(shù)據(jù)庫（miRbase）最新統(tǒng)計［3］，目前已發(fā)現(xiàn)的人類前體 miRNA（pri－miRNA）已超過1800種，表達成熟miRNA產(chǎn)物已超過2500種。

EMT可誘導許多病理過程，如慢性炎癥、器官纖維化、高分化癌等。典型的上皮細胞具有游離面－基底面的極性特征，細胞間具有緊密連接和黏附連接，不能夠隨意地遷移。EMT過程中，上皮細胞喪失正常極性并獲得侵襲遷移能力，伴隨細胞內(nèi)骨架蛋白的改變和多種細胞表面標志物的表達變化，主要表現(xiàn)為上皮表型相關分子如E－鈣黏素（E－cad）、角蛋白、纖維粘連蛋白（FN）等的減少，以及間質(zhì)表型相關分子如α－平滑肌肌動蛋白（α－SMA）、波形蛋白（Vimentin）、鈣結合蛋白S100A4等的增加。

2 EMT相關通路

2.1 Wnt信號通路

Wnt基因包括兩個高度同源基因，即小鼠乳癌細胞int－1基因和果蠅無翅wingless（wg）基因，故合稱為 Wnt基因［4］。Wnt通路主要包括：Wnt蛋白（Wnt配體）及其受體（卷曲家族蛋白Frz），低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP）、松散蛋白（Dsh／Dvl）、β－catenin、糖原合成酶激酶3β（GSK－3β）、軸抑制因子（Axin）、家族性腺瘤性息肉病基因（APC）等。Wnt／β－catenin經(jīng)典通路為：Wnt配體與其受體Frz結合后，可激活細胞內(nèi)的 Dsh／Dvl，并進一步抑制 GSK－3β／Axin／APC復合物對β－catenin的磷酸化作用，β－catenin降解隨之減少并在細胞內(nèi)積聚，而后進入細胞核并激活c－myc、survivin和cyclin D基因的轉(zhuǎn)錄［5］。研究表明，miR－939可通過下調(diào)APC來抑制Wnt通路，并促進卵巢癌細胞的增殖［6］。

2.2 PI3K／Akt／mTOR通路

研究顯示，PI3K／Akt／mTOR通路主要由磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt／PKB）及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）構成［7］。PI3K／Akt／mTOR通路的大致激活過程為：生長因子、細胞因子、神經(jīng)肽等與相應受體結合形成復合體，該復合體激活PI3K的p110催化亞基，使底物Ptd Ins（4，5）P2轉(zhuǎn)化為 Ptd Ins（3，4，5）P3，PIP3隨后與 Akt氨基端調(diào)節(jié)區(qū)PH結構域（pleckst rin homology domain）結合，使Akt向細胞膜募集。而后Akt的兩個磷酸化位點（Thr－308／Ser－473）分別被PI3K依賴激酶1（PDK1）／PI3K 依賴激酶2（PDK2）磷酸化。激活后的Akt可以直接磷酸化mTOR使其激活，或通過滅活結節(jié)性硬化復合物1／2（TSC1／2）以增強mTOR的活性。GSK－3β是 Wnt信號通路和PI3K／Akt／mTOR通路的共同信號分子，提示各信號通路間相互影響。有研究表明，在卵巢癌細胞株中下調(diào)miRNA－150可以激活PI3K／Akt通路并降低癌細胞對帕妥珠單抗的敏感性［8］。

2.3 Hedgehog信號通路

Hedgehog是一種分節(jié)極性基因，哺乳動物中有3種Hedgehog同源基因：SHH、DHH和IHH。經(jīng)典SHH信號通路的構成：SHH配體，跨膜蛋白受體Ptch、Smo，Gli蛋白家族。Gli蛋白家族包括轉(zhuǎn)錄促進因子Gli1、Gli2，轉(zhuǎn)錄抑制因子Gli3，三者相互作用引起靶基因過表達，并最終導致腫瘤發(fā)生。Hedgehog信號通路的作用機制為：當SHH缺少時，Ptch與Smo結合使Smo失活，Gli失去Smo的刺激作用后表達減少且不斷被蛋白酶水解，從而導致靶基因表達受抑制；當SHH過表達時，SHH作為配體與Ptch結合使其與Smo分離，Smo隨后激活Gli的過表達并引起靶基因的高表達，最終引起腫瘤的發(fā)生。已有多項研究證實，Hedgehog信號通路的激活與卵巢癌密切相關［9］。

2.4 TGF－β／Smad信號通路

轉(zhuǎn)化生長因子－β（TGF－β）屬于 TGF－β超家族，體外培養(yǎng)成纖維細胞時，若加入表皮生長因子（EGF）和TGF－β，成纖維細胞不再貼壁生長，并能在瓊脂中生長，密度抑制效應隨之消失。TGF－β除了誘導EMT的發(fā)生外，可在體外誘導正常成纖維細胞（NF）向腫瘤相關成纖維細胞（CAF）的轉(zhuǎn)變［10］。TGF－β與細胞表面Ⅰ型受體Ⅱ型受體結合后，Ⅰ、Ⅱ型受體構型發(fā)生改變形成復合體，使Smad2與Smad3磷酸化并進一步與Smad4結合，隨后進入細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)相應靶基因的轉(zhuǎn)錄。已有研究證實，TGF－β能夠激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（TG2），TG2可上調(diào)鋅指增強子結合蛋白1（ZEB1）、下調(diào)E－cad表達，從而誘導卵巢癌EMT過程，而這一過程主要是經(jīng)Samd通路和TGF－β激活激酶（TAK1）／NF－κB途徑來實現(xiàn)的［11］。

2.5 其他信號通路

Notch信號通路：直接作用于轉(zhuǎn)錄因子Snail的啟動子以上調(diào)Snail水平；還可在缺氧誘導因子－1α（HIF－1α）存在的情況下上調(diào)賴氨酰氧化酶（LOX）以穩(wěn)定Snail，減少Snail的降解，最終誘導EMT過程［12］。研究結果表明，上皮性卵巢癌中高表達Snail對腫瘤的發(fā)生和進展具有協(xié)同作用［13］。此外，NF－κB、肝細胞生長因子（HGF）、表皮生長因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等多種信號通路都參與了EMT的過程［14］。

3 卵巢癌發(fā)生EMT及其相關miRNA的調(diào)控機制

3.1 miR－200家族

3.1.1 miR－200家族與卵巢癌發(fā)生發(fā)展 序列（尤其是種子序列）高度同源miRNA通常被歸為一個家族。miR－200家族主要包括miR－200a／b／c、miR－141、miR－429。內(nèi)源性miR－200家族可與 E－cad轉(zhuǎn)錄抑制因子 ZEB1／2的3′UTR結合，抑制ZEB轉(zhuǎn)錄因子的翻譯，從而維持E－cad的表達水平，在 MET／EMT過程中起到重要作用［15］。研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細胞系HEY中，miR－429的過表達可以誘導 MET過程，伴隨細胞形態(tài)的改變和ZEB1／2的下降及E－cad的升高［16］。但 BENDORAITE等［17］發(fā)現(xiàn)ZEB1／2也可以反向抑制miR－200家族的表達并在一定程度上逆轉(zhuǎn)miR－200家族誘導的MET過程。EMT／MET這種雙向抑制的反饋通路在結直腸癌中也已被證實，miR－34可以抑制Snail的表達：miR－34通過與Snail的3′UTR結合；反之Snail也可以抑制miR－34的表達：Snail通過與miR－34啟動子上的E－boxes結合［18］。在卵巢癌的相關研究中，miR－200家族表達水平既有上升也有下降［17］。這提示miR－200家族在卵巢癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的不同時期起到不同的作用。不妨假設，在腫瘤發(fā)展早期，miR－200家族表達下調(diào)，隨之E－cad表達水平降低，細胞間黏附作用下降，腫瘤細胞獲得侵襲能力；當腫瘤已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移時，miR－200家族表達上調(diào)，誘導腫瘤細胞發(fā)生MET過程，以利于腫瘤細胞在遠處的定植。OLSON等［19］的研究部分驗證了這一過程：通過RT2小鼠體外構建多步驟腫瘤發(fā)生模型發(fā)現(xiàn)，只有當瘤細胞進展到類轉(zhuǎn)移原發(fā)瘤期或轉(zhuǎn)移瘤期時，miR－200家族才會明顯地下調(diào)。

3.1.2 miR－200家族與卵巢癌耐藥 已有研究證實，卵巢癌細胞發(fā)生EMT后對鉑類藥物的耐藥性會顯著上升［20］，而miR－200家族尤其是 miR－429可以逆轉(zhuǎn) EMT過程［16］，根據(jù)該逆轉(zhuǎn)過程是否伴隨卵巢癌細胞恢復對鉑類藥物敏感性的這一設 想，JABBARI等［21］在卵巢 癌細胞系 SKOV－3 和HEY－A8中分別過表達miR－200家族各成員，并隨后進行順鉑耐藥性實驗，結果發(fā)現(xiàn)過表達miR－429與miR－141對卵巢癌細胞順鉑敏感性的恢復最高，miR－200c與miR－200a次之，miR－200b較差。JABBARI等［21］認為這與 miR－200家族各成員間非種子序列的差異性有關。

3.1.3 miR－200家族與卵巢癌預后 腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移以后預后很差，卵巢癌亦是如此。HU等［22］對55例晚期卵巢癌miRNA 表達水平分析后結果顯示，miR－200a、miR－200b、miR－429與卵巢癌復發(fā)及遠期生存率密切相關，其表達水平越低，預后越差。EITAN等［23］的研究結果顯示，在Ⅲ期卵巢癌中 miR－200a、miR－34a、miR－449b下調(diào)最為顯著，其中miR－200a與病人總生存期密切相關。腫瘤誘發(fā)miRNA表達后在血清－血漿中穩(wěn)定存在且不受內(nèi)源性RNA酶的影響，因此血清或血漿標本都可以用以檢測miRNA的含量［24］。miR－429被認為除可以作為卵巢癌發(fā)生EMT的標志物外，還對抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移具有一定的治療價值［10］。

3.2 其他 miRNA

除了miR－200家族外，尚有許多miRNA參與了卵巢癌EMT過程。CHAO等［25］研究發(fā)現(xiàn)，miR－187在卵巢惡性腫瘤中表達上調(diào)，但與之相反的是miR－187的表達水平卻與總生存率及無復發(fā)生存率呈正相關。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌發(fā)生的最初階段miR－187異常表達可以抑制其靶基因Dab2（一種抑癌基因），并引起癌細胞過度增殖，隨后在卵巢癌進展晚期，持續(xù)上調(diào)的miR－187可以抑制Dab2依賴的EMT過程。YANG等［18］通過對459例晚期卵巢癌病例的分析研究發(fā)現(xiàn)，提高miR－506的表達可以上調(diào)E－cad水平，抑制EMT過程，最終降低癌細胞的增殖侵襲能力。

4 展望

卵巢惡性腫瘤整體預后不良，上皮性卵巢癌病死率居婦科惡性腫瘤首位。卵巢腫瘤的組織學分型在目前人類實體腫瘤中也最為復雜多樣，這在一定程度上加大了其診斷和治療難度。隨著對EMT及其相關microRNA調(diào)控機制研究的深入，將為卵巢癌發(fā)病機制的解釋、化療方案選擇及預后判斷提供了新的思路。如 miR－429與ZEB1／2、miR－34與Snail的雙向抑制反饋通路首先通過EMT過程使癌細胞獲得轉(zhuǎn)移侵襲能力，而后又在腫瘤進展晚期通過MET過程使腫瘤細胞在遠處組織器官定植，這為解釋腫瘤的轉(zhuǎn)移機制提供了新的觀點。

雖然miRNA對EMT的調(diào)控機制研究已取得長足進展，但miRNA數(shù)量龐大，其調(diào)控的EMT通路間錯綜復雜，且不同病理類型的卵巢癌組織中其miRNA表達存在較大差異。進一步深入研究各EMT通路的機制及其的關鍵調(diào)節(jié)分子，將為臨床診斷、預后判斷、化療方案的選擇提供指導和依據(jù)。

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