張國(guó)英，夏學(xué)紅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京210014)

微生物標(biāo)本培養(yǎng)前涂片革蘭染色鏡檢的臨床意義

張國(guó)英，夏學(xué)紅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京210014)

目的探討臨床上微生物送檢標(biāo)本在培養(yǎng)前進(jìn)行涂片鏡檢的臨床意義。方法對(duì)365例臨床送檢的不同類(lèi)型的微生物標(biāo)本先進(jìn)行涂片染色檢查，再接種進(jìn)行培養(yǎng)，分析二者的符合率。結(jié)果365例送檢標(biāo)本中，有痰液標(biāo)本211例，尿液標(biāo)本40例，分泌物標(biāo)本76例，其他標(biāo)本(主要是膿液及胸腹水標(biāo)本)38例，其中有不合格標(biāo)本17例。348例合格標(biāo)本中培養(yǎng)陽(yáng)性93例，其中痰液標(biāo)本、尿液標(biāo)本、分泌物標(biāo)本和其它標(biāo)本的涂片與培養(yǎng)結(jié)果間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，符合率分別為76.6%、62.5%、87.1%和80.0%。結(jié)論微生物標(biāo)本培養(yǎng)前的涂片鏡檢不僅可以檢查送檢標(biāo)本的質(zhì)量，而且可以減少培養(yǎng)結(jié)果的誤差，有效提高標(biāo)本培養(yǎng)的陽(yáng)性檢出率，在實(shí)際微生物檢驗(yàn)工作中具有十分重要的意義。

涂片;鏡檢;培養(yǎng);微生物標(biāo)本

隨著國(guó)家抗菌藥物整治工作的深入，臨床對(duì)微生物檢驗(yàn)結(jié)果的依賴(lài)程度越來(lái)越高，微生物培養(yǎng)及藥物敏感性結(jié)果逐漸成為指導(dǎo)臨床感染性疾病診斷和治療的重要依據(jù)。檢驗(yàn)結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠直接關(guān)系到臨床醫(yī)生合理用藥是否有效[1]。而微生物送檢標(biāo)本質(zhì)量的好壞，病原微生物能否被及時(shí)、有效地檢出，均關(guān)系到藥物敏感性結(jié)果的準(zhǔn)確與否。如何及時(shí)篩除臨床不合格的送檢標(biāo)本，如何盡早發(fā)現(xiàn)有意義的致病菌，對(duì)送檢標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)前的涂片染色鏡檢應(yīng)該是行之有效的方法和手段。

材料和方法

一、材料

1.標(biāo)本來(lái)源收集2013年從南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病區(qū)和門(mén)診送檢的微生物標(biāo)本365例，其中痰液標(biāo)本211例、尿液標(biāo)本40例、分泌物標(biāo)本76例、其它標(biāo)本(主要是膿液及胸腹水標(biāo)本) 38例。標(biāo)準(zhǔn)菌株[金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)]購(gòu)自江蘇省臨床檢驗(yàn)中心。

2.試劑和儀器快速革蘭染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，ATB微生物鑒定儀及其配套的鑒定板條(法國(guó)生物梅里埃公司)。

二、方法

1.涂片染色鏡檢用無(wú)菌棉簽挑取痰液、分泌物及膿液標(biāo)本中膿性、黏液或血性的部位，制成均勻薄片。尿液及胸腹水:取新鮮標(biāo)本5～8 mL，置于無(wú)菌試管1500×g離心30 min，取沉渣涂片。待涂片自然干燥后做革蘭染色、鏡檢。

2.合格標(biāo)本及陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)痰液標(biāo)本:外觀(guān)為膿性或血性，鱗狀上皮細(xì)胞＜10個(gè)/低倍鏡視野，白細(xì)胞＞25個(gè)/低倍鏡視野[2]，另外有些標(biāo)本白細(xì)胞數(shù)量上沒(méi)有＞25個(gè)/低倍鏡視野，但見(jiàn)到了明顯形態(tài)、染色特征的致病菌，如流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌等，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)并向臨床回報(bào)涂片檢查結(jié)果。尿液標(biāo)本:觀(guān)察10個(gè)以上油鏡視野，平均每個(gè)視野有1個(gè)以上細(xì)菌者，說(shuō)明感染的可能性大，作進(jìn)一步培養(yǎng);還要觀(guān)察細(xì)菌的種類(lèi)，如果有3種以上細(xì)菌同時(shí)存在，則標(biāo)本可能被污染，應(yīng)重新留取。分泌物、膿液及胸腹水標(biāo)本:無(wú)菌采集，涂片如有大量鱗狀上皮細(xì)胞存在則說(shuō)明標(biāo)本留取過(guò)程中被污染，或培養(yǎng)見(jiàn)到2種或2種以上細(xì)菌即疑為標(biāo)本被污染[3]。培養(yǎng)結(jié)果與涂片的符合情況:培養(yǎng)檢出的致病菌與涂片鏡檢中疑似致病菌形態(tài)特點(diǎn)相符[4]。疑似致病菌的確認(rèn)指標(biāo):首先區(qū)分致病菌和污染菌(了解標(biāo)本取材部位附近的常居菌叢的分布情況)，其次在鏡下找到細(xì)菌或真菌被炎性細(xì)胞吞噬或伴行，或被炎性細(xì)胞所包裹的現(xiàn)象[5]。

3.培養(yǎng)及鑒定痰液標(biāo)本分別接種在血平板、巧克力平板、麥康凱平板、科瑪嘉平板[5%CO2濃度，(35±2)℃]，孵育24～48 h;分泌物、尿液和膿液標(biāo)本接種在血平板、麥康凱平板;胸腹水標(biāo)本接種在血平板、麥康凱平板及肉湯增菌液中，放置于(35±2)℃恒溫箱孵育24～48 h。觀(guān)察純培養(yǎng)菌或優(yōu)勢(shì)致病菌并挑取菌落涂片進(jìn)行革蘭染色、分離，用ATB微生物鑒定儀鑒定。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、不合格標(biāo)本的篩除

按照合格標(biāo)本的判定標(biāo)準(zhǔn)，365例送檢標(biāo)本中有不合格標(biāo)本17例，其中痰液標(biāo)本12例，尿液標(biāo)本5例，培養(yǎng)后菌落生長(zhǎng)情況與鏡檢相符(痰液標(biāo)本為唾液痰，菌落生長(zhǎng)較少，或見(jiàn)到3種以上細(xì)菌，多為正常菌群;尿液標(biāo)本被污染，見(jiàn)到3種以上細(xì)菌生長(zhǎng))。見(jiàn)表1。

二、涂片鏡檢與培養(yǎng)的陽(yáng)性符合率比較

348例合格標(biāo)本中檢出致病菌93株，其中痰液標(biāo)本檢出47株，尿液標(biāo)本檢出7株，分泌物標(biāo)本檢出30株，其它標(biāo)本檢出9株。各菌株檢出情況見(jiàn)表1。348例合格標(biāo)本中，痰液、尿液、分泌物和其它標(biāo)本涂片鏡檢與培養(yǎng)結(jié)果間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，陽(yáng)性符合率分別為76.6%、62.5%、87.1%和80.0%。見(jiàn)表2。

三、涂片鏡檢與培養(yǎng)檢出微生物類(lèi)型的符合率比較

348例合格標(biāo)本中，痰液標(biāo)本涂片鏡檢與培養(yǎng)檢出微生物類(lèi)型的符合率分別為陽(yáng)性球菌50.0%、陰性桿菌70.0%、真菌93.3%;尿液標(biāo)本分別為66.7%、50.0%、100.0%;分泌物標(biāo)本分別為75.0%、88.5%、100.0%;其它標(biāo)本則分別為66.7%、85.7%、0.0%。在348例合格標(biāo)本中，2種方法均未見(jiàn)到具有明顯致病性的陽(yáng)性桿菌、陰性球菌和其它類(lèi)型的微生物。見(jiàn)表3。

討論

目前，臨床上涂片鏡檢主要是將臨床送來(lái)作微生物檢驗(yàn)的各類(lèi)標(biāo)本涂成薄片進(jìn)行革蘭染色，在顯微鏡下直接觀(guān)察微生物的有無(wú)及其形態(tài)，其功能主要有以下幾點(diǎn):(1)鑒別細(xì)菌;(2)選擇藥物敏感性紙片;(3)早期診斷;(4)判定合格標(biāo)本; (5)確定主要病原菌;(6)病原菌半定量;(7)查腹瀉菌群失調(diào);(8)提示需補(bǔ)充檢查項(xiàng)目;(9)解釋培養(yǎng)結(jié)果;(10)有利于細(xì)菌鑒定[6]。

本研究分析的365例送檢標(biāo)本中不合格標(biāo)本17例。從鏡檢情況看，12例不合格痰標(biāo)本均滿(mǎn)足白細(xì)胞＜10個(gè)/低倍視野，而鱗狀上皮細(xì)胞＞25個(gè)/低倍視野要求，從性狀觀(guān)察均為唾液，培養(yǎng)結(jié)果均為正常菌群;尿液標(biāo)本有5例不合格，涂片鏡檢沉渣發(fā)現(xiàn)革蘭陽(yáng)性球菌、革蘭陰性桿菌、革蘭陽(yáng)性桿菌，培養(yǎng)結(jié)果與鏡檢相符，故判定為“標(biāo)本污染”。所以培養(yǎng)前標(biāo)本涂片鏡檢可以及時(shí)排除不合格標(biāo)本，糾正標(biāo)本采集錯(cuò)誤，提高檢驗(yàn)結(jié)果的正確性和及時(shí)性[4－5]。這樣既減少了患者的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也避免了由于標(biāo)本的不合格所導(dǎo)致的錯(cuò)誤培養(yǎng)結(jié)果給臨床造成的誤診、誤治[1]。

348例合格標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)共檢出致病菌93株，而經(jīng)涂片鏡檢陽(yáng)性79例，兩者經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有較好的符合率。對(duì)其不符合的病例進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其中涂片陰性而培養(yǎng)陽(yáng)性13例，分析原因，可能有以下幾種:(1)涂片太薄或取材不當(dāng)，不能如實(shí)反映標(biāo)本的真實(shí)性;(2)涂片經(jīng)革蘭染色后，背景為紅色，而革蘭陰性桿菌也為紅色，容易漏檢，這一現(xiàn)象在痰液標(biāo)本中較多見(jiàn);(3)有些細(xì)菌如不動(dòng)桿菌屬，其鏡下形態(tài)呈革蘭陰性球桿菌，與奈瑟菌相似，易混淆;(4)不排除標(biāo)本在接種過(guò)程中的污染。涂片陽(yáng)性而培養(yǎng)陰性3例，原因可能有以下幾種:(1)涂片中看到的細(xì)菌被膿細(xì)胞吞噬后，白細(xì)胞及死亡后的尸體釋放出某些物質(zhì)抑制了細(xì)菌的繁殖;(2)標(biāo)本中有厭氧菌，用常規(guī)需氧條件培養(yǎng)，不會(huì)生長(zhǎng);(3)標(biāo)本中有苛氧菌、緩慢生長(zhǎng)菌或L型菌，用常規(guī)條件培養(yǎng)，可能會(huì)因?yàn)榕囵B(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)不夠、培養(yǎng)時(shí)間短、培養(yǎng)環(huán)境不適宜等因素而不生長(zhǎng);(4)標(biāo)本采集前未停用抗菌藥物，患者體內(nèi)殘存的抗菌藥物抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)[6－7]。但由于本研究標(biāo)本較少，具體原因還需擴(kuò)大標(biāo)本量進(jìn)一步研究。

通過(guò)比較分析，認(rèn)為標(biāo)本培養(yǎng)前的涂片鏡檢與培養(yǎng)結(jié)果具有很大的相關(guān)性，據(jù)此可以向臨床提供一級(jí)報(bào)告，提前提供感染信息，這對(duì)指導(dǎo)預(yù)防用藥有積極意義[6]。目前，臨床上由于微生物檢驗(yàn)的特殊性，從標(biāo)本采集到給臨床明確的檢驗(yàn)結(jié)果，包括病原學(xué)診斷和抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果一般需要2～3 d，有時(shí)需要更長(zhǎng)的時(shí)間，而此時(shí)患者的病情可能已經(jīng)發(fā)生了變化[4]。因此，在標(biāo)本送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，對(duì)其先行染色鏡檢，并將鏡檢結(jié)果提前告知臨床，可為臨床醫(yī)生試探性合理用藥指明方向。同時(shí)又可以排除不合格標(biāo)本，提高致病菌的檢出率[5]，為確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和及時(shí)性提供有效幫助，從而提高患者治療的有效率，縮短住院時(shí)間，節(jié)約醫(yī)療經(jīng)費(fèi)。所以，對(duì)我們從事微生物檢驗(yàn)工作的人員來(lái)說(shuō)，對(duì)臨床送檢的微生物標(biāo)本進(jìn)行涂片染色鏡檢有著十分重要的意義，大家在實(shí)際工作中應(yīng)加強(qiáng)重視。

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The clinical significance of smear and Gram staining for microscopy before microbial specimens being cultured

ZHANG Guoying，XIA Xuehong.(Department of Clinical Laboratory，Nanjing Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu Nanjing 210014，China)

ObjectiveTo investigate the clinical significance of microbial specimens being smeared and Gram stained for microscopy before they were cultured.MethodsA total of 365 clinical specimens with different types of microorganisms were firstly smeared and stained for microscopy，then were inoculated for culture.Finally，the coincidence rate was analyzed.ResultsAmong the 365 specimens，there were 211 sputum specimens，40 urine specimens，76 secretion specimens and 38 other－type specimens(mainly pus and pleural effusion specimens).Among them，there were 17 unqualified specimens.Of the 348 qualified specimens，93 cases were cultured positive.The detection results of sputum，urine，secretion and other－type specimens were no statistical significance by the smear microscopy and the culture method.The coincidence rates were 76.6%，62.5%，87.1%and 80.0%，respectively (P＞0.05).ConclusionsThe smear microscopy can not only check the quality of specimens，but also reduce the result errors of culture，so as to improve the positive rate of specimens by culture.Therefore，it is of great significance in the actual microbiological testing work.

Smear;Microscopy;Culture;Microbial specimen

1673－8640(2015)03－0258－04

R446.5

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.014

2014－04－01)

(本文編輯:姜敏)

張國(guó)英，女，1978年生，碩士，副主任技師，主要從事微生物學(xué)和免疫學(xué)研究。