楊林聲，王理論，杜青衛(wèi)

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，陜西 延安 716000）

microRNA-215對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及抑癌基因Rb1表達(dá)的調(diào)控作用

楊林聲，王理論，杜青衛(wèi)

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，陜西 延安 716000）

目的 研究microRNA-215(miR-215)在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)組織中的表達(dá)及其臨床意義，并探討其對(duì)RB細(xì)胞活力、增殖及凋亡的影響。方法采用qRT-PCR檢測(cè)51例RB患者及相應(yīng)癌旁組織中miR-215的表達(dá)并分析其與患者臨床病理特征的相關(guān)性。在RB細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-215類似物或miR-215抑制物，采用噻唑藍(lán)比色法(MTT)、溴脫氧尿苷(BrdU)細(xì)胞增殖分析、Caspase3活性檢測(cè)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活力、增殖及凋亡的影響。Western blot檢測(cè)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白1(Rb1)表達(dá)變化。結(jié)果miR-215在RB組織中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織(P＜0.01)；miR-215表達(dá)與視神經(jīng)浸潤(rùn)(P=0.002)及分化程度(P=0.041)有關(guān)；miR-215在RB細(xì)胞系Y79及HXO-Rb44中的表達(dá)水平顯著高于其在正常視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞ACBRI-181中的表達(dá)水平(P＜0.01)；miR-215抑制物顯著降低HXO-Rb44細(xì)胞中miR-215的表達(dá)水平并導(dǎo)致細(xì)胞活力降低、增殖能力下降、胞內(nèi)Caspase3活性增加及凋亡細(xì)胞百分比增加；miR-215類似物顯著升高Y79細(xì)胞中miR-215的表達(dá)水平并導(dǎo)致細(xì)胞活力升高、增殖能力增強(qiáng)及凋亡細(xì)胞百分比降低。同時(shí)，下調(diào)HXO-Rb44細(xì)胞中miR-215水平顯著升高細(xì)胞內(nèi)Rb1蛋白表達(dá)水平，過表達(dá)Y79細(xì)胞中miR-215水平顯著降低細(xì)胞內(nèi)Rb1蛋白表達(dá)水平。結(jié)論miR-215在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)升高且與惡性臨床病理特征相關(guān)。miR-215可增強(qiáng)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力、增殖能力并減少細(xì)胞凋亡，并可降低細(xì)胞內(nèi)Rb1蛋白表達(dá)，提示miR-215在視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

MicroRNA-215；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；腫瘤生長(zhǎng)；臨床意義

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Retinoblastoma，RB)是發(fā)生于視網(wǎng)膜核層、具有家族傾向、多發(fā)于5歲以下嬰幼兒的一種惡性腫瘤[1-2]。該腫瘤易發(fā)生顱內(nèi)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常危及患兒生命[3-4]。因此，尋找RB早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，探明其發(fā)生發(fā)展的分子信號(hào)機(jī)制并發(fā)現(xiàn)能有效抑制其發(fā)生發(fā)展的治療靶點(diǎn)，對(duì)提高RB的診治水平，改善患兒預(yù)后具有重要意義。在RB組織中，抑癌基因Rb1存在低表達(dá)，是導(dǎo)致RB發(fā)生的重要分子基礎(chǔ)[3]。研究表明，Rb1在RB組織中的低表達(dá)可能與基金突變、表觀遺傳修飾等多種分子機(jī)制有關(guān)[5]。然而，RB組織及細(xì)胞中microRNA的異常表達(dá)是否會(huì)導(dǎo)致Rb1低表達(dá)，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，目前仍不明確。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-215(miR-215)在多種腫瘤組織中存在異常表達(dá)[6-8]，并在腫瘤增殖[6]、遷移及侵襲[7]等多種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要功能。然而，miR-215在RB組織及細(xì)胞中的表達(dá)及生物學(xué)功能，以及其是否能夠抑制Rb1蛋白的表達(dá)，目前尚不明確。本課題通過檢測(cè)miR-215在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)，分析其與RB患者臨床病理特征的關(guān)系，并應(yīng)用人工合成的miR-215的抑制物和類似物探明miR-215在RB發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能及其對(duì)Rb1的調(diào)控作用，為將miR-215確立為RB的新生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科2001年1月至2014年12月經(jīng)病理診斷為RB并行手術(shù)摘除眼球患者51例。51例患者的就診年齡為3個(gè)月至9歲，平均(3.2±1.9)歲；男性19例，女性32例；單眼20例，雙眼31例；分化型14例，未分化型37例；發(fā)生神經(jīng)浸潤(rùn)30例，未發(fā)生神經(jīng)浸潤(rùn)21例。術(shù)前均未接受化療及局部放療等治療。本研究獲得所有患者監(jiān)護(hù)人知情同意及醫(yī)院的倫理學(xué)審核。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 RNA提取所用的TRIzol購(gòu)自于美國(guó)Life Technologies公司；PrimeScript reverse transcription-PCR(RT-PCR)試劑盒購(gòu)自Takara公司；TaqMan miRNA Reverse Transcription試劑盒及TaqMan Human MiRNA Assay試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems公司；人正常視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞系A(chǔ)CBRI-181和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤系Y79及HXO-Rb44購(gòu)自于美國(guó)模式菌種收集中心(American Type Culture Collection，ATCC)；細(xì)胞培養(yǎng)所用的DMEM購(gòu)自 Hyclone公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染用的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；MiRNA質(zhì)粒包括miR-215表達(dá)質(zhì)粒(miR-215 mimics)、miR-215抑制質(zhì)粒(miR-215 inhibitor)及其相應(yīng)的對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自Genecopoeia公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物公司；兔抗人Rb1多克隆抗體及鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自Cell signaling公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 根據(jù)TRIzol?操作說明書提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA。使用TaqMan miRNA Reverse Transcription試劑盒(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)和TaqMan Human MiRNA Assay試 劑 盒 (Applied Biosystems)定量檢測(cè)miR-215表達(dá)?！鳌鰿t法用于計(jì)算miR-215相對(duì)于U6的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞ACBRI-181和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79及HXO-Rb44培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Gibco，USA)、1%青霉素/鏈霉素(Sigma，USA)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，飽和濕度下培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代2～3代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)將miRNA質(zhì)粒包括miR-215表達(dá)質(zhì)粒(miR-215 mimics)、miR-215抑制質(zhì)粒(miR-215 inhibitor)及其相應(yīng)的對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤系細(xì)胞，并應(yīng)用潮霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用培養(yǎng)基制備細(xì)胞數(shù)為1×105/ml的單細(xì)胞懸液，以200 μl/孔接種于96孔板。接種細(xì)胞24 h、48 h、72 h后MTT檢測(cè)細(xì)胞活力。在檢測(cè)細(xì)胞活力前4 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT；孵育4 h后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μl，于室溫輕微溶解結(jié)晶15 min。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔。酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光值。

1.3.5 Brdu-ELISA法測(cè)定細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用培養(yǎng)基制備細(xì)胞數(shù)為1×105/ml的單細(xì)胞懸液，以200 μl/孔接種于96孔板并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)結(jié)束前每孔加入20 μl BrdU標(biāo)記液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制：加BrdU培養(yǎng)結(jié)束后，加入Fix Denat使DNA變性，然后每孔加100 μl HRP標(biāo)記的抗BrdU抗體，洗滌3次，每孔加入100 μl TMB底物液顯色，20 min后加1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，置振蕩器上1 min，在酶標(biāo)儀上以450 nm/630 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)吸光值，即BrdU值。每組設(shè)3個(gè)副孔。

1.3.6 Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase-3的活性 胰酶消化轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，800 r/min離心5 min棄掉胰酶。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，2 000 r/min離心5 min，收集(3～5)×106個(gè)細(xì)胞。在收集的沉淀細(xì)胞中加入50 μl預(yù)冷的Lysis Buffer，并置于冰上裂解20～30 min，期間渦旋震蕩3～4次；隨后，將上述裂解液于4℃離心機(jī)以10 000 r/min離心1 min。吸取裂解液上清至新的EP管中，并置于冰上備用；取少量上清液，并用BCA法測(cè)定其中的蛋白濃度。吸取50μl含有100～200 μg蛋白的細(xì)胞裂解上清，并加入50μl的2×Reaction buffer，使用前每50μl的2×Reaction buffer加入0.5μl DTT；隨后加入5 μl Caspase-3 Substrate，并于37℃避光孵育4 h。利用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值。

1.3.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取轉(zhuǎn)染后48 h后的細(xì)胞，用0.01 mol/L PBS洗滌細(xì)胞，800 r/min離心5 min后棄去上清，用1×Binding buffer重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，每管加入500 ul細(xì)胞懸液、5μl Annexin V-FITC和10 μl PI?；靹蚴覝乇芄夥跤?0 min后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.8 Western blot利用RIPA試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(BCA kit)檢測(cè)蛋白樣品濃度。取40μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后，利用濕轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入5%牛血清蛋白(BSA)稀釋的Rb1多克隆抗體(1:1 000)及β-actin單克隆抗體(mAb，1:1 500)4℃孵育過夜后，加HRP標(biāo)記二抗(1:10 000)，室溫孵育2 h。最后利用ECL化學(xué)發(fā)光劑暗室顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPPSS13.0和GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-215在RB組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá) 應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)miR-215在51例骨肉瘤及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果提示miR-215在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織[(1.170±0.255)vs(1.940±0.102)，t=2.800，P＜0.05]，見圖1。

圖1 miR-215在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤及其對(duì)應(yīng)瘤旁組織中的表達(dá)水平

2.2 miR-215表達(dá)水平與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者臨床病例特征的相關(guān)性 將miR-215在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)水平的中位值定為界值，miR-215表達(dá)水平低于中位值者歸為miR-215低表達(dá)組，miR-215表達(dá)水平等于或高于中位值的患者歸為miR-215高表達(dá)組。miR-215表達(dá)與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者臨床病理特征之間的相關(guān)性詳見表1，結(jié)果顯示骨肉瘤組織中miR-215表達(dá)與視神經(jīng)浸潤(rùn)(χ2= 9.206，P=0.002)及分化程度(χ2=3.878，P=0.041)有顯著相關(guān)性。

表1 miR-215表達(dá)與RB患者臨床病理特征的關(guān)系（n=51）

2.3 miR-215在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平 采用qRT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系Y79、HXO-Rb44和人正常視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞ACBRI-181細(xì)胞中miR-215的表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果表明：miR-215在Y79及HXO-Rb44中的表達(dá)水平顯著高于其在ACBRI-181細(xì)胞中的表達(dá)[(0.977±0.065)vs (1.770±0.047)，t=9.882，P＜0.01；(0.977±0.065)vs (2.510±0.102)，t=12.670，P＜0.01]，見圖2。

圖2 miR-215在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系及正常視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.4 下調(diào)miR-215導(dǎo)致HXO-Rb44細(xì)胞活力及增殖能力減弱，凋亡增加 為進(jìn)一步研究miR-215在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的生物學(xué)功能，將miR-215抑制物轉(zhuǎn)染HXO-Rb44細(xì)胞，進(jìn)而檢測(cè)細(xì)胞活力、增殖能力及凋亡的變化。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，miR-215抑制物能夠顯著下調(diào)HXO-Rb44細(xì)胞中miR-215的表達(dá)(P＜0.01，圖3A)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：下調(diào)miR-215的表達(dá)后，HXO-Rb44細(xì)胞活力顯著下降(P＜0.01，圖3B)；BrdU細(xì)胞增殖分析檢測(cè)細(xì)胞增殖能力變化顯示：下調(diào)miR-215導(dǎo)致HXO-Rb44細(xì)胞增殖能力顯著減弱(P＜0.05，圖3C)；另一方面，Caspase-3活性檢測(cè)表明：下調(diào)miR-215的表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性顯著增加(P＜0.01，圖3D)；同時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示：下調(diào)miR-215表達(dá)后，HXO-Rb44細(xì)胞的凋亡比例顯著增加(P＜0.01，圖3E)。

圖3 下調(diào)miR-215對(duì)HXO-Rb44細(xì)胞活力、增殖能力及凋亡的影響

2.5 上調(diào)miR-215導(dǎo)致Y79細(xì)胞活力及增殖能力增強(qiáng)，凋亡減少 為進(jìn)一步證實(shí)miR-215調(diào)控細(xì)胞活力、增殖及凋亡的影響，進(jìn)一步利用miR-215類似物轉(zhuǎn)染Y79細(xì)胞，進(jìn)而檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞活力、增殖能力及凋亡的變化。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，miR-215類似物轉(zhuǎn)染能夠顯著升高上調(diào)Y79細(xì)胞內(nèi)miR-215的表達(dá)水平(P＜0.01，圖4A)；功能學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明：上調(diào)miR-215表達(dá)后，MTT結(jié)果顯示Y79細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)(P＜0.05，圖4B)，BrdU細(xì)胞增殖分析表明細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)(P＜0.01，圖4C)， Caspase-3活性檢測(cè)提示細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性顯著降低(P＜0.05，圖4D)，同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果提示凋亡細(xì)胞比例顯著降低(P＜0.05，圖4E)。

2.6 miR-215調(diào)控視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中Rb1蛋白的表達(dá)RB1是重要的抑癌基因，Rb1蛋白低表達(dá)是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的重要特征，Rb信號(hào)調(diào)節(jié)途徑是一種主要的抑癌方式，在抑制細(xì)胞增生方面具有重要的作用。為探明miR-215能否下調(diào)HXO-Rb44細(xì)胞中Rb1蛋白表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的作用，進(jìn)一步利用Western blot法檢測(cè)下調(diào)miR-215后HXO-Rb44細(xì)胞中Rb1蛋白的表達(dá)水平。檢測(cè)結(jié)果表明：下調(diào)miR-215表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)Rb1蛋白的表達(dá)顯著增加(P＜0.01，圖5A)。另一方面，miR-215 mimics轉(zhuǎn)染后Y79細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Rb1蛋白的表達(dá)顯著降低(P＜0.01，圖5B)。

圖4 過表達(dá)miR-215對(duì)Y79細(xì)胞活力、增殖能力及凋亡的影響

圖5 MiR-215對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中Rb1蛋白的表達(dá)變化

3 討論

MiRNAs是細(xì)胞內(nèi)一組長(zhǎng)度較短的(約22個(gè)核苷酸)內(nèi)源性非編碼RNA[9]，可通過與靶mRNAs的3'端非編碼區(qū)域的識(shí)別序列部分互補(bǔ)結(jié)合，最終導(dǎo)致mRNAs降解或翻譯受阻。越來越多的證據(jù)表明：miRNAs在多種細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮決定性作用[10-11]，如分化、形態(tài)發(fā)生和腫瘤發(fā)生。在人類腫瘤發(fā)生中，miRNAs可發(fā)揮促癌或者抑癌的生物學(xué)功能，并可作為腫瘤早期診斷及預(yù)后評(píng)估的有效生物學(xué)標(biāo)志物[12]。本研究表明：相較于正常癌旁組織，miR-215在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中存在顯著高表達(dá)；同時(shí)，miR-215的異常高表達(dá)與患者的不良病理特征存在顯著相關(guān)性。這表明：miR-215可能作為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者早期診斷及預(yù)后評(píng)估的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

增殖能力增強(qiáng)及凋亡減少是腫瘤細(xì)胞的重要生物學(xué)特征，也是腫瘤發(fā)生進(jìn)展的重要生物學(xué)基礎(chǔ)[13]。本研究的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：上調(diào)miR-215后，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)而凋亡顯著減少；下調(diào)miR-215后，其增殖能力顯著減弱而凋亡顯著增加。因此，這些研究結(jié)果表明：miR-215可以通過增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力，減少細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)功能。

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，抑癌基因RB缺失、突變及表達(dá)減少在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[5]，如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、肺癌、胃癌、膀胱癌及乳腺癌等。同時(shí)，大量研究表明miRNAs表達(dá)或功能異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因[9-10]。miRNAs可通過下調(diào)腫瘤內(nèi)抑癌基因的表達(dá)或上調(diào)促癌基因的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在胃癌中的研究表明，miR-215能夠下調(diào)胃癌組織中Rb1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮增強(qiáng)胃癌細(xì)胞增殖的作用[6]。本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：上調(diào)miR-215后，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中Rb1蛋白的表達(dá)顯著降低，而下調(diào)miR-215后，細(xì)胞內(nèi)Rb1蛋白表達(dá)顯著增高。這提示miR-215能夠通過抑制細(xì)胞內(nèi)Rb1蛋白的表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的作用。

總之，本研究證實(shí)：在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中miR-215表達(dá)顯著增加且與患者不良臨床病理特征相關(guān)；miR-215可發(fā)揮促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力及抑制其凋亡的能力；同時(shí)，miR-215能夠顯著抑制細(xì)胞內(nèi)Rb1蛋白的表達(dá)。本研究結(jié)果表明miR-215有望成為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤早期診斷和預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物，并可能成為視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因治療的潛在靶點(diǎn)。

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Regulatory effect of MicroRNA-215 on the growth of human retinoblastoma cells and the expression of Rb1.

YANG Lin-sheng,WANG Li-lun,DU Qing-wei.Department of Ophthalmology,the Affiliated Hospital of Yan'an University,Yan'an 716000,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the clinical significance and functional role of microRNA-215 (miR-215)in retinoblastoma(RB)tissues and cells,and to analyze the effect of miR-215 on cell viability,proliferation and apoptosis.MethodsWe detected miR-215 expression in 51 samples of RB and the matched normal tumor-adjacent tissues using qRT-PCR.The expression level of miR-215 was altered by corresponding vectors(miR-215 inhibitor and miR-215 mimic)in RB cells.And then MTT,BrdU cell proliferation,Caspase3 activity and flow cytometry assay were performed to examine the viability,proliferation and apoptosis of RB cells.Western blot was used to detect thealteration of Rb1 expression after the over-expression or down-expression of miR-215.ResultsThe expression level of miR-215 in RB tissues was significantly higher than that in normal tumor-adjacent tissues(P＜0.01).The expression of miR-215 in tumor tissues was significantly associated with optic nerve infiltration(P=0.002)and differentiated degree(P=0.041).The expression levels of miR-215 in RB cell lines Y79 and HXO-Rb44 were significantly higher than that in retinal microvascular endothelial cells ACBRI-181(P＜0.01).MiR-215 expression was significantly inhibited by miR-215 inhibitor in HXO-Rb44 cells,and down-expression resulted in significantly decreased cell viability and proliferation,as well as increased apoptosis.On the contrast,MiR-215 expression was significantly improved by miR-215 mimic in Y79 cells,and the over-expression led to significantly increased cell viability and proliferation,as well as decreased apoptosis.Besides,the down-expression of miR-215 in HXO-Rb44 cells significantly increased the level of Rb1,while the over-expression of miR-215 in Y79 cells significantly decreased the level of Rb1.ConclusionIncreased expression of miR-215 is correlated with the adverse clinicopathological features of retinoblastoma.MiR-215 may regulate cell viability,proliferation and apoptosis of retinoblastoma cells by targeting Rb1, suggesting miR-215 may play a key role in the development and progression of retinoblastoma.

MicroRNA-215;Retinoblastoma;Tumor growth;Clinical significance

R739.7

A

1003—6350（2015）24—3592—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.24.1300

2015-07-26)

陜西省科技廳項(xiàng)目（編號(hào)：2013KJXX31）

王理論。E-mail：yanglinsheng783@163.com