樊林花， 劉茂林， 衛(wèi)兵艷， 劉田福， 王春芳 龐文彪， 郭永昌， 劉建新

(1山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物和人類疾病動物模型山西省重點實驗室，山西 太原 030001； 2山西省一○九醫(yī)院，山西 太原 030006)

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·短篇論著·

周脂素和ADRP在糖代謝異常大鼠肝臟組織中的表達(dá)*

樊林花1， 劉茂林1， 衛(wèi)兵艷1， 劉田福1， 王春芳1龐文彪1， 郭永昌1， 劉建新2△

(1山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物和人類疾病動物模型山西省重點實驗室，山西 太原 030001；2山西省一○九醫(yī)院，山西 太原 030006)

目的： 探討脂滴相關(guān)蛋白周脂素(perilipin)和脂肪分化相關(guān)蛋白(ADRP)在糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中的變化情況以及在糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝中的作用。方法: 分別用高脂飼料喂養(yǎng)和高脂飼料喂養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素建立糖耐量受損(IGT)和2型糖尿病大鼠模型(T2DM)，采用光鏡觀察各組大鼠肝組織的形態(tài)學(xué)改變；用ELISA法測定血清周脂素perilipin和ADRP含量；real-time PCR 技術(shù)檢測肝臟組織中perilipin和ADRP mRNA的表達(dá)；用 Western blotting法檢測肝臟組織中ADRP蛋白的表達(dá)。結(jié)果: HE結(jié)果顯示， IGT組和 T2DM組大鼠均有肝細(xì)胞脂肪變性，IGT組變性更嚴(yán)重；各模型組的生化指標(biāo)與臨床相關(guān)疾病的表現(xiàn)一致；血清perilipin水平各組之間無差異，但I(xiàn)GT組和T2DM組肝組織perilipin mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與IGT組相比，T2DM組perilipin mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)。T2DM組血清ADRP含量較其對照組明顯降低(P<0.01)；模型組肝組織ADRP mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)；ADRP蛋白表達(dá)較其對照組也明顯降低(P<0.01)；與IGT組相比，T2DM組ADRP mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)。結(jié)論: 血清ADRP含量在T2DM的形成中起一定的作用，與胰島素抵抗指數(shù)呈明顯負(fù)相關(guān)；高脂喂養(yǎng)后能導(dǎo)致大鼠糖代謝異常，并伴有非酒精性脂肪肝的發(fā)生；糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝的發(fā)生可能與肝組織perilipin表達(dá)升高和ADRP表達(dá)降低有關(guān)。

周脂素； 脂肪分化相關(guān)蛋白； 糖耐量受損； 2型糖尿病

2型糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和脂代謝紊亂是其主要特征，研究表明，脂肪分解途徑紊亂可能是聯(lián)系IR和糖代謝異常時高脂血癥的重要環(huán)節(jié)[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)脂滴相關(guān)蛋白perilipin和ADRP等對脂肪的代謝調(diào)節(jié)具有重要作用[2-3]。盡管脂代謝紊亂在糖尿病中發(fā)揮著重要作用，但就perilipin和ADRP而言在糖代謝異常的不同病理狀態(tài)下研究較少，且尚未見在糖耐量受損階段的相關(guān)報道，因此，本實驗室建立糖耐量受損(impaired glucose tolerance，IGT)大鼠模型和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)大鼠模型，觀察不同糖代謝狀態(tài)下血清及肝組織周脂素(perilipin)和ADRP的表達(dá)狀況，旨在探討perilipin和ADRP在糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中的變化，以及在糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要儀器與試劑

酶標(biāo)儀(BioTeK)；全自動生化測定儀(Beckman Coulter Lx-20)，所用試劑、質(zhì)控及標(biāo)準(zhǔn)均為Beckman 生產(chǎn)；高速冷凍離心機(jī)(Sigma)；德國羅氏優(yōu)越H型血糖儀及試紙，熒光定量PCR儀(ABI 7300)；垂直電泳儀(Bio-Rad)；鏈脲佐菌素(Sigma)；GPO-PAP試劑盒(南京建成生物研究所)；Perilipin、ADRP與胰島素ELISA試劑盒(R&D)；ADRP和GAPDH抗體(Abclonal Biotechnology)；RNAiso Plus總RNA提取試劑、RT試劑盒、PCR試劑盒以及perilipin、ADRP和β-actin引物由寶生物工程大連有限公司提供或合成。

2 動物模型的建立及樣本收集

健康SD大鼠60只，雄性，清潔級，體質(zhì)量170～210 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[合格證編號為SCXY(晉)2009-0001]，飼養(yǎng)于本中心屏障環(huán)境動物實驗室[合格證編號為SYXY(晉)2009-0004]，將大鼠隨機(jī)分為IGT模型組(IGT)、IGT對照組(control)、2型糖尿病組(T2DM)和糖尿病對照組(T2DM control)，對照組飼喂普通飼料 (3.2 kCal/g，其中脂肪、碳水化合物和蛋白質(zhì)分別提供熱量10.2%、66.5%和23.3%)，模型組飼喂高脂飼料(5.24 kCal/g，其中脂肪、碳水化合物和蛋白質(zhì)分別提供熱量 60%、20%和 20%)，自由飲水，IGT組及其對照組共飼養(yǎng)12周。2型糖尿病組飼喂高脂飼料4周后，腹腔注射小劑量STZ(35 mg/kg)[4]，其對照組腹腔注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。每4周測量1次體重。

IGT組高脂飼養(yǎng)12周后，進(jìn)行口服糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)，選出OGTT中2 h血糖值在7.8～11.1 nmol/L且伴有胰島素抵抗[用胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)來評判]者為IGT大鼠[5]。糖尿病組于注射鏈脲佐菌素72 h后，檢測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，選擇FBG高于11.1 nmol/L為2型糖尿病大鼠模型[6]。選擇擬處死大鼠禁食12 h以上，稱重，腹主動脈采血，分離血清，在-80 ℃保存，備測生化指標(biāo)、脂滴相關(guān)蛋白和胰島素水平。迅速摘取肝臟，切取同一部位肝組織以備病理檢測；另取一部分用鋁箔包好液氮速凍后，凍存于-80 ℃冰箱，以備real-time PCR和Western blotting以及肝組織甘油三酯檢測。每組選取6份樣本進(jìn)行real-time PCR和Western blotting檢測。

3 主要方法

3.1 血清perilipin、ADRP和空腹胰島素(fasting insulin, FINS)含量的檢測 ELISA法測定血清perili-pin、ADRP和FINS含量，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

3.2 血生化指標(biāo)檢測 FBG及2 h OGTT血糖用快速血糖儀測量；甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)用全自動生化測定儀測定，按照操作規(guī)程和試劑使用說明進(jìn)行；HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

3.3 大鼠肝組織脂質(zhì)含量測定 取300 mg肝臟組織，經(jīng)氯仿/甲醇抽提TG后，分離水相物質(zhì)和有機(jī)相物質(zhì)，吸取有機(jī)相物質(zhì)，應(yīng)用GPO-PAP試劑盒測肝組織TG含量。

3.4 肝臟組織病理學(xué)檢查 肝臟組織經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋， 4 μm厚度切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)改變。

3.5 實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測肝臟perilipin和ADRP mRNA的表達(dá) 剪取凍存的肝組織 50 mg， 按試劑說明書操作， 提取總 RNA， 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA， 然后進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增， 以β-actin作為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt值表示目的基因的相對表達(dá)量。Perilipin的上游引物為5’-CGAGTCACAACCCCACGAT-3’，下游引物為5’-TCAGCCCACGAGAGAGGAA-3’；ADRP的上游引物為5’-CGTGGAAAGGACCAAGTCTG-3’，下游引物為5’-TTCTGAGTGAGCGGCAAGTA-3’；β-actin的上游引物為5’-CCACCCGCGAGTACAACCTTC-3’，下游引物為5’-CCCATACCCACCATCACACC-3’。 擴(kuò)增條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，循環(huán)40次。

3.6 Western blotting法檢測肝臟組織中ADRP蛋白的表達(dá) 提取肝組織總蛋白，用BCA法定量，將定量好的組織蛋白變性后，進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)到NC膜，麗春紅染色后用蒸餾水脫色至褪去。將裁好的膜置于蛋白干粉的封閉液中(室溫輕搖1 h)。將封閉好的膜置于 I 抗稀釋液中(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗滌后加入HRP標(biāo)記的 II 抗中室溫孵育1 h，洗滌后，DAB顯色，Bandscan軟件對顯影條帶進(jìn)行灰度分析，將ADRP灰度值與內(nèi)參照GAPDH灰度值的比值作為其蛋白的相對表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以單因素方差分析比較各組的均數(shù)差異；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠體質(zhì)量的變化及成模情況

各組大鼠實驗起始(0 d)體質(zhì)量無差異，從30 d開始，至實驗結(jié)束，各模型組體質(zhì)量明顯高于其對照組(P<0.01)。隨時間延長，兩者體質(zhì)量的差距雖然呈進(jìn)行性增加,但其差距的增長幅度有所降低。IGT組20只大鼠，成模12只，成模率為60%，T2DM組20只死亡6只，其余的全部成模，見表1。

表1 各組不同時點體質(zhì)量變化

**P<0.01vsIGT control;##P<0.05vsT2DM control.

2 各組大鼠生化指標(biāo)檢測結(jié)果

與各自對照組相比，IGT組和T2DM組血清FINS、TG、TC、HOMA-IR、ALT和肝組織TG水平明顯升高(P<0.05)；IGT組與其對照組相比，血清FBG、AST、ADRP和perilipin含量無顯著差異(P>0.05)；T2DM組與其對照組相比，血清FBG、AST和perilipin含量無顯著差異(P>0.05)，ADRP含量明顯降低(P<0.01)；與IGT組相比，T2DM組FBG、HOMA-IR和TC明顯升高(P<0.01)，F(xiàn)INS和肝組織的TG明顯降低(P<0.01)；IGT對照組與T2DM對照組相比，除ADRP含量顯著降低外(P<0.01)，其余各指標(biāo)均無顯著差異，見表2。

表2 各組大鼠生化指標(biāo)檢測結(jié)果

*P<0.05,**P<0.01vsIGT control;##P<0.01vsT2DM control;△△P<0.05vsIGT.

3 各組肝組織病理學(xué)變化

IGT對照組的肝組織基本正常，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整清晰，偶見胞漿內(nèi)有小脂滴；T2DM對照組肝組織正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則；IGT組的肝細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)有大小不等的脂滴，部分脂滴形成大空泡，將細(xì)胞核擠向一側(cè)，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴存在，肝脂肪變性明顯并伴有炎癥細(xì)胞浸潤，可見點狀或小灶性壞死；T2DM組的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，大部分肝細(xì)胞體積增大，大小不均，多數(shù)細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的脂滴，小葉內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤，伴有散在的點狀壞死，肝組織脂肪變性沒有IGT組嚴(yán)重，見圖1。

Figure 1.Morphological changes of the liver tissues in different groups (HE staining, ×200).

4 不同糖代謝大鼠肝臟組織perilipin和ADRP mRNA表達(dá)的變化

與各自對照組相比，IGT組和T2DM組的肝組織perilipin mRNA表達(dá)明顯升高，分別是各自對照組的(1.87±0.28)倍和(2.17±0.13)倍(P<0.01)；ADRP mRNA表達(dá)明顯降低，分別是各自對照組的(77±14)%和(47±5)%(P<0.01)；與IGT組相比，T2DM組perilipin mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，ADRP mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of perilipin and ADRP in the liver tissues. Mean±SD. n=6. *P<0.01 vs IGT control; #P<0.05 vs T2DM control; △P<0.05, △△P<0.01 vs IGT.

5 不同糖代謝大鼠肝臟組織ADRP的蛋白表達(dá)水平

與各自對照組相比，IGT組和T2DM組的肝組織ADRP蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.01)；與IGT組相比，T2DM組的ADRP蛋白表達(dá)水平有所降低，但無顯著差異(P>0.05)，見圖3。

Figure 3.The protein expression of ADRP in liver tissues. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs IGT control; ##P<0.01 vs T2DM control.

6 Perilipin和ADRP與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清perilipin水平與各指標(biāo)沒有相關(guān)性，但肝組織perilipin mRNA表達(dá)與FBG、HOMA-IR、TG、TC、ALT及肝組織TG呈明顯正相關(guān)(P<0.05)，與血清ADRP含量和肝組織ADRP mRNA及蛋白表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.01)；血清ADRP含量與肝組織mRNA及蛋白表達(dá)呈明顯正相關(guān)(P<0.01)，與HOMA-IR、TG、ALT及肝組織TG呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)；肝組織ADRP mRNA及蛋白表達(dá)均與HOMA-IR、FINS、FBG、TG、TC、ALT和肝組織TG呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

討 論

本實驗采用單純高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠復(fù)制IGT模型，該模型組大鼠體重明顯增加，12周時空腹血糖與對照組血糖相比無顯著差異，但OGTT 2 h明顯升高，達(dá)到了糖耐量受損的診斷標(biāo)準(zhǔn)，成模率為60%，且判斷胰島素抵抗的指標(biāo)——HOMA-IR與對照組相比有顯著差異，說明已形成胰島素抵抗，肥胖IGT大鼠模型復(fù)制成功；以高脂飼料加小劑量STZ復(fù)制T2DM模型， 該組體重增加明顯，空腹血糖比對照組明顯升高，除個別死亡外，全部達(dá)到了T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)，HOMA-IR也明顯增大，說明T2DM模型制備成功。所制備的模型均具有高胰島素血癥、高脂血癥、胰島素抵抗和肝臟脂質(zhì)沉積等特點，這些與臨床相應(yīng)的IGT和T2DM在生化指標(biāo)方面相符，符合糖尿病發(fā)生發(fā)展的慢性病理過程。

IGT是一種糖代謝介于正常和糖尿病之間的血糖異常代謝狀態(tài)，此階段屬于糖尿病前期，在此期間出現(xiàn)的癥狀未達(dá)到糖尿病標(biāo)準(zhǔn)，不易引起足夠重視，但體內(nèi)糖代謝平衡已破壞，成為T2DM及其并發(fā)癥風(fēng)險的一個重要誘因，因此IGT階段的監(jiān)測和干預(yù)具有重要意義。非酒精性脂肪肝就是糖耐量受損階段以及2型糖尿病期間發(fā)生的并發(fā)癥之一[7]。本實驗肝臟HE染色顯示，IGT組由于高脂飼料喂養(yǎng)相對較長，肝組織脂肪變性嚴(yán)重；T2DM組脂肪變性較IGT組有所減輕，IGT對照組雖未用高脂飼料喂養(yǎng)，但實驗周期相對較長，體重增加也明顯，肝組織內(nèi)偶見脂肪變性細(xì)胞，T2DM對照組肝組織未見有脂肪變性細(xì)胞，這與生化檢測指標(biāo)相一致，能夠代表不同糖代謝異常下肝組織的病理狀態(tài)用于后續(xù)研究。

脂肪細(xì)胞最主要成分是細(xì)胞內(nèi)脂滴，其表面覆蓋如perilipin和ADRP等多種脂滴相關(guān)蛋白，這些蛋白對脂滴的代謝和調(diào)節(jié)具有重要作用[8]，目前對于perilipin和ADRP的研究尚處于起步階段，主要集中在脂解及肥胖等方面，而且在肥胖研究中存在爭議[9-10]，在糖異常狀態(tài)下表達(dá)情況報道較少。因此本實驗檢測了糖代謝異常大鼠血清及肝臟組織中perilipin和ADRP的表達(dá)水平，探討perilipin和ADRP在糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中以及在糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝中是否起一定的作用。實驗結(jié)果顯示，各組大鼠血清中perilipin含量無差異，但模型組肝組織中perilipin mRNA表達(dá)均明顯升高，與Kenr等[10]在脂肪組織中的研究結(jié)果相一致。相關(guān)分析也表明肝組織perilipin mRNA表達(dá)與FBG、HOMA-IR、血清TG、肝組織TG呈明顯正相關(guān)，說明perilipin的明顯升高參與了糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝的發(fā)生。 T2DM模型組較其對照組血清ADRP明顯降低，在IGT模型組及對照組之間無顯著差異，相關(guān)分析表明，血清ADRP含量與HOMA-IR、血清TG、血清ALT、肝組織TG呈明顯負(fù)相關(guān)，說明血清ADRP在T2DM的形成中起一定的作用，而且IGT對照組其含量較T2DM對照組也明顯降低，這似乎暗示，在糖代謝正常的情況下，體重對血清ADRP含量有很大的影響。但肝組織ADRP mRNA和蛋白表達(dá)水平均表明，模型組較各自的對照組均明顯降低，與文獻(xiàn)報道不一致[11]，這可能與體內(nèi)外實驗的不同有關(guān)，有待進(jìn)一步加以驗證。相關(guān)分析表明，肝組織ADRP mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)均與HOMA-IR、FINS、FBG、TG、TC、ALT和肝組織TG呈明顯負(fù)相關(guān)。說明ADRP明顯降低參與了糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝的發(fā)生。

綜上所述，分別采用單純高脂飼料喂養(yǎng)和高脂飼料加小劑量鏈脲佐菌素可以復(fù)制IGT模型和T2DM模型，能夠代表不同糖代謝異常病理狀態(tài)用于后續(xù)研究。血清perilipin水平各組間表達(dá)無顯著差異，與胰島素抵抗指數(shù)也無相關(guān)性；但血清ADRP含量較T2DM對照組明顯降低，而且IGT對照組也明顯降低，這說明除糖脂代謝異常影響血清ADRP的水平外，似乎體重對其影響也很明顯。模型組肝組織perilipin mRNA表達(dá)均明顯升高，ADRP mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低，說明糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝的發(fā)生可能與其perilipin表達(dá)的上調(diào)和ADRP表達(dá)的降低有關(guān)，其具體機(jī)制需進(jìn)一步實驗研究加以探討。

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Expression of perilipin and ADRP in rat liver tissues with abnormal glucose metabolism

FAN Lin-hua1, LIU Mao-lin1, WEI Bing-yan1, LIU Tian-fu1, WANG Chun-fang1, PANG Wen-biao1, GUO Yong-chang1, LIU Jian-xin2

(1LaboratoryAnimalCenterofShanxiMedicalUniversity,ShanxiKeyLaboratoryofExperimentalAnimalsandAnimalMo-delsforHumanDiseases,Taiyuan030001,China;2109HospitalofShanxiProvince,Taiyuan030006,China.E-mail:jianxinliu_690101@sina.com)

AIM: To observe the changes of perilipin and adipose differentiation-related protein (ADRP) du-ring the development of diabetes mellitus and to explore the effect of perilipin and ADRP on abnormal glucose metabolism with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). METHODS: The rat model of impaired glucose tolerance (IGT) was induced by feeding high-fat diet, and the type 2 diabetes mellitus (T2DM) model was induced by feeding high-fat diet for 4 weeks and intraperitoneally injecting streptozotocin. The morphological change of the liver tissue was observed under optical microscope. The serum contents of perilipin and ADRP were measured by ELISA. The mRNA expression of perilipin and ADRP in the liver tissues was detected by real-time PCR. The protein expression of ADRP in the liver tissues was determined by Western blotting. RESULTS: HE staining showed steatosis in the liver of the rats in IGT group was more serious than that in T2DM group. The biochemical and the pathological processes of rat models were consistent with the clinical feature of related diseases. The serum content of perilipin had no difference among various groups. The mRNA expression of perilipin in IGT group and T2DM group was significantly higher than that in control group. Compared with IGT group, the mRNA expression of perilipin in T2DM group was significantly increased. The serum content of ADRP in T2DM group was significantly lower than that in control group. The mRNA and protein expression of ADRP in model groups was significantly lower than that in control group. Compared with IGT group, the mRNA expression of ADRP in T2DM group was significantly reduced. CONCLUSION: The serum content of ADRP plays a role in the development and progression of T2DM. It is negatively correlated with HOMA-IR. NAFLD occurs during progression of abnormal glucose metabolism induced by feeding high-fat diet. The development of abnormal glucose metabolism with NAFLD is probably related to the increased expression of perilipin and the reduced expression of ADRP.

Perilipin; Adipose differentiation-related protein; Impaired glucose tolerance; Type 2 diabetes mellitus

1000- 4718(2015)03- 0534- 05

2014- 08- 18

2014- 12- 24

山西省實驗動物專項資金資助項目(No. 2013k11); 山西醫(yī)科大學(xué)科技創(chuàng)新基金資助項目(No.01201425)

△通訊作者 Tel: 0351-2676672； E-mail: jianxinliu_690101@sina.com

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.026