胡 明， 黎 佼， 劉寧寧， 黃楨鈞， 伍崇海， 鐘 赟， 劉世明

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260)

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miR-486-5p在氧化應(yīng)激引起人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡中的作用*

胡 明▲， 黎 佼▲， 劉寧寧， 黃楨鈞， 伍崇海， 鐘 赟， 劉世明△

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260)

目的： 觀察microRNA-486-5p(miR-486-5p)在氧化應(yīng)激引起人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)凋亡中的作用并探討其作用機(jī)制。方法: hMSCs經(jīng)培養(yǎng)鑒定后分為5組：空白對(duì)照組、H2O2組、miR-486-5p模擬物+H2O2組、抑制物(αnti-miR)+H2O2組及相應(yīng)的陰性對(duì)照(scrambled control)+H2O2組。熒光定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)hMSCs凋亡過(guò)程中miR-486-5p的表達(dá)變化。用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染miR-486-5p的模擬物、抑制物及陰性對(duì)照到hMSCs。應(yīng)用MTT、Hoechst標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)miR-486-5p對(duì)氧化應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞活性下降及凋亡效應(yīng)的影響，Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白、Akt與其磷酸化水平，采用試劑盒測(cè)定caspase-3活性。結(jié)果: H2O2誘導(dǎo)hMSCs凋亡過(guò)程中miR-486-5p的表達(dá)較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)。與陰性對(duì)照組相比，在hMSCs中過(guò)表達(dá)miR-486-5p，能使細(xì)胞在氧化應(yīng)激情況下活性顯著下降，凋亡發(fā)生率增高，蛋白Bcl-2/Bax比值、caspase-3酶原含量及Akt磷酸化水平降低，caspase-3活性增強(qiáng)；而使用抑制物阻遏miR-486-5p的作用后，細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下活性增加，凋亡發(fā)生率降低，蛋白Bcl-2/Bax比值及Akt磷酸化水平升高，caspase-3活性下降。結(jié)論: 過(guò)表達(dá)miR-486-5p促進(jìn)氧化應(yīng)激引起的hMSCs凋亡，阻遏miR-486-5p的作用抑制氧化應(yīng)激條件下的hMSCs凋亡，其中作用機(jī)制可能與調(diào)控Akt通路有關(guān)。

MicroRNA-486-5p； 間充質(zhì)干細(xì)胞； 氧化應(yīng)激； 細(xì)胞凋亡

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作為成體干細(xì)胞的一種,由于來(lái)源方便，沒(méi)有免疫排斥反應(yīng)，無(wú)致瘤性，是較為理想且具有臨床運(yùn)用前景的一類(lèi)干細(xì)胞。移植BMSCs治療心梗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床前期試驗(yàn)取得了令人鼓舞的成果，但臨床試驗(yàn)效果差異較大，而且獲益主要來(lái)自于早期的心功能改善，對(duì)遠(yuǎn)期全因死亡等終點(diǎn)事件無(wú)明顯改善，這其中心梗后局部惡劣的微環(huán)境限制了移植細(xì)胞的存活是主要原因之一。心梗發(fā)生后，心肌缺血缺氧的同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成增多，啟動(dòng)氧化應(yīng)激反應(yīng)(oxidative stress，OS)。移植到心梗周邊區(qū)的BMSCs會(huì)因缺血缺氧而誘發(fā)凋亡，同時(shí)也會(huì)在氧化應(yīng)激作用下發(fā)生損傷。因此，如果能夠采取方法減少梗死后微環(huán)境誘發(fā)的移植細(xì)胞凋亡，將對(duì)提高干細(xì)胞移植療效有重大意義。微小RNA(microRNA，miRNA)作為細(xì)胞內(nèi)一類(lèi)重要的調(diào)控分子，調(diào)控著細(xì)胞分化、增殖、代謝及凋亡等一系列生物學(xué)過(guò)程[1]。過(guò)表達(dá)miR-486-5p促進(jìn)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose tissue-derived MSCs，hAT-MSCs)復(fù)制性衰老[2]，低劑量的H2O2也可誘導(dǎo)MSCs提早發(fā)生衰老，而大劑量H2O2誘發(fā)凋亡[3]，那么我們推測(cè)miR-486-5p可能在H2O2誘導(dǎo)的MSCs凋亡中起作用。本研究擬通過(guò)H2O2刺激細(xì)胞模擬心梗后局部微環(huán)境中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)移植的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)凋亡，觀察miR-486-5p在氧化應(yīng)激引起hMSCs凋亡中的作用并探討其可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 人骨髓的提取 通過(guò)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，并與患者簽訂知情同意書(shū)后，在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心外科瓣膜病患者開(kāi)胸手術(shù)過(guò)程中吸取人骨髓5mL。供體排除腫瘤、肝炎、結(jié)核、HIV感染等因素。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清、Opti-MEM和IMDM培養(yǎng)基(Gibco)；3% H2O2(Sigma)；Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)；SYBR Green 熒光定量試劑盒和RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo)；Annexin V-FITC Apoptosis detection kit(eBioscience)；caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(Beyotime)；兔抗Akt、p-Akt和caspase-3抗體(Cell signalling)；Bax、Bcl-2及GAPDH抗體(Santa Cruz)；淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)；熒光定量PCR儀(ABI7300)；多功能酶標(biāo)儀(Tecan)等。

2 方法

2.1 hMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及H2O2預(yù)處理 hMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定參照文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]。在淋巴細(xì)胞分離液上疊加入人骨髓液，以2 000 r/min在4 ℃下離心20min，吸取分離液和血漿界面云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞，用IMDM懸浮并以1 000 r/min離心。后按2×109/m2密度接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，48h后換液，將不貼壁的細(xì)胞除去。貼壁細(xì)胞每3d換液，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，胰酶消化傳代。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD29、CD31、CD34、CD44、CD45和CD166的表達(dá)。選擇P3/P4代細(xì)胞，首先細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h，然后用H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)凋亡，參見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，細(xì)胞在無(wú)血清IMDM培養(yǎng)8 h，然后加入10 mmol/L H2O2處理8 h以誘導(dǎo)凋亡，后按實(shí)驗(yàn)需要處理細(xì)胞。

2.2 Real-time PCR檢測(cè)H2O2誘導(dǎo)hMSCs凋亡過(guò)程中miR-486-5p的表達(dá)變化 按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟提取貼壁培養(yǎng)的hMSCs的總RNA；按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(37 ℃ 15min，98 ℃ 5min)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作在ABI7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)PCR循環(huán)。miRNA使用U6作為內(nèi)參照進(jìn)行PCR，獲得Ct值后，目的基因的相對(duì)定量按2-ΔΔCt計(jì)算。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按Lipofectamine RNAiMAX說(shuō)明書(shū)操作，hMSCs密度達(dá)70%～80%時(shí)分別轉(zhuǎn)染miR-486-5p模擬物、抑制物(anti-miR)及其相應(yīng)的陰性對(duì)照miR-CTL、anti-CTL，轉(zhuǎn)染終濃度為30 nmol/L，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后進(jìn)行H2O2預(yù)處理。轉(zhuǎn)染一般步驟參見(jiàn)轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)。相關(guān)miRNA序列見(jiàn)表1。

表1 DNA和RNA寡核苷酸序列

F: forward; R reverse.

2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以100 μL每孔(約6×103個(gè)細(xì)胞)接種于96孔板。按實(shí)驗(yàn)要求給予不同處理，每組設(shè)5個(gè)平行孔。處理完畢后，每孔加入50 μL MTT，孵育4 h后吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，水平搖床搖勻，待藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀在550 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度(A)。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A×100%。

2.5 Hoechst 33342染色觀測(cè)凋亡細(xì)胞 將hMSCs接種在24孔板上，各實(shí)驗(yàn)組按要求給予不同處理，PBS洗1～2次后加入4%多聚甲醛于4 ℃固定細(xì)胞30 min，后PBS洗滌1次，再加10 mg/L Hoechst 33342于37 ℃染色15 min后立即熒光檢測(cè)。正常細(xì)胞核出現(xiàn)均勻強(qiáng)度的熒光；如出現(xiàn)染色質(zhì)固縮和(或)核碎裂則為凋亡的細(xì)胞。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各實(shí)驗(yàn)組按實(shí)驗(yàn)要求給予不同處理后，按Annexin V-FITC凋亡測(cè)定試劑盒(eBioscience)中的操作步驟，每實(shí)驗(yàn)組收集2×105個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌1次，離心后重懸于200 μL緩沖液，加入5 μL Annexin V-FITC混合，室溫下避光孵育10 min。而后加入10 μL PI并立即通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V+/PI-視為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V+/PI+和Annexin V-/PI+為晚期凋亡和死亡細(xì)胞，Annexin V-/PI-則為活細(xì)胞。

2.7 Western blotting檢測(cè)Akt、p-Akt、caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白水平 每組收集約4×105個(gè)細(xì)胞，蛋白裂解液進(jìn)行蛋白提取，BCA法測(cè)定蛋白濃度。各組等量蛋白用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)過(guò)蛋白的硝酸纖維素膜于室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，而后與相應(yīng)Ⅰ抗于4 ℃下孵育過(guò)夜 [多克隆兔抗磷酸化Akt(1∶500)、Akt(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)或兔抗Bax(1∶500)，鼠抗Bcl-2(1∶100)]。TBST洗膜后連接辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶5 000)作為探針。目的蛋白特異條帶化學(xué)發(fā)光法顯影，經(jīng)GAPDH(1∶5 000)信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化，并通過(guò)Image-Pro Plus軟件半定量分析，磷酸化與非磷酸化蛋白的比值代表蛋白磷酸化水平。

2.8 Caspase-3的活性測(cè)定 每組收集約4×105細(xì)胞，PBS洗滌1次后，加入25 μL裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min后4 ℃ 16 000×g離心10min,提取上清后立即按caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明測(cè)定活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩組間的差異顯著性采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間的差異顯著性采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 hMSCs氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡中miR-486-5p的表達(dá)變化

如圖1A所示，采用H2O2誘導(dǎo)hMSCs凋亡后，用real-time PCR方法檢測(cè)miR-486-5p的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，H2O2組miR-486-5p的表達(dá)水平較control組明顯下調(diào)(P<0.05)。

2 miR-486-5p對(duì)H2O2引起hMSCs活性下降的影響

如圖1B所示，H2O2刺激后，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-486-5p模擬物的hMSCs的細(xì)胞活性顯著下降；而抑制miR-486-5p的表達(dá)則能使hMSCs的細(xì)胞活性增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Figure 1.The changes of miR-486-5p expression in oxidative stress-related apoptosis of hMSCs (A) and the effect of miR-486-5p on H2O2-induced decrease in cell viability (B). SC:scrambled control.Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs SC+H2O2.

3 miR-486-5p在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)hMSCs凋亡中的作用

如圖2所示，Hoechst熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察到control組細(xì)胞核出現(xiàn)均勻的低強(qiáng)度熒光；而在各H2O2處理組中均出現(xiàn)胞核濃縮致密、呈顆粒狀高強(qiáng)度的熒光。轉(zhuǎn)染miR-486-5p組與陰性對(duì)照組相比，濃縮致密、顆粒狀高強(qiáng)度熒光明顯增多；而miR-486-5p抑制物組相比對(duì)照組，濃縮致密的高強(qiáng)度熒光減少。Annexin/PI雙染色法流式檢測(cè)顯示，H2O2處理后，早凋和晚凋細(xì)胞比例相對(duì)control組均顯著增加(P<0.05)。氧化應(yīng)激處理后，轉(zhuǎn)染miR-486-5p模擬物的hMSCs與陰性對(duì)照組的早期凋亡率分別為7.80%±1.68%和6.09%±0.76%，而晚期凋亡率分別為19.72%±3.86%和15.48%±2.63%，這說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-486-5p促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的hMSCs凋亡；而抑制miR-486-5p的表達(dá)則拮抗H2O2誘導(dǎo)的hMSCs凋亡(P<0.05)。

Figure 2.The role of miR-486-5p in H2O2-induced hMSC apoptosis. A: apoptosis of hMSCs analyzed by Hoechst 33342 staining. Brightly stained nucleus of hMSCs represents the cells undergoing apoptosis (×20). B: apoptosis was also analyzed by flow cytometry after staining with Annexin V and propidium iodide (PI). C: the quantitative analysis of apoptosis. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs SC (scambled control)+H2O2.

4 miR-486-5p對(duì)氧化應(yīng)激介導(dǎo)hMSCs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、Akt磷酸化水平及caspase-3活性的影響

Akt磷酸化水平在經(jīng)過(guò)H2O2處理后明顯下降(P<0.05)。與陰性對(duì)照組相比，在hMSCs中過(guò)表達(dá)miR-486-5p，能使細(xì)胞在氧化應(yīng)激情況下，Bcl-2/Bax比值、caspase-3酶原含量及Akt磷酸化水平下降(P<0.05)；而使用抑制物阻遏miR-486-5p的作用后，Bcl-2/Bax比值、caspase-3酶原含量和Akt磷酸化水平升高(P<0.05)。H2O2刺激后，過(guò)表達(dá)miR-486-5p造成caspase-3活性增加，而轉(zhuǎn)染miR-486-5p抑制物組與陰性對(duì)照組相比，caspase-3活性顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The levels of apoptosis-related proteins and phosporylation of Akt determined by Western blotting, and the caspase-3 activity detected by a kit in transfected hMSCs after treated with H2O2. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs anti-control+H2O2; #P<0.05 vs miR-control+H2O2; △P<0.05 vs control; ▲P<0.05 vs SC+H2O2.

討 論

心梗發(fā)生后，心肌缺血缺氧和再灌注損傷過(guò)程中，ROS生成增多，清除減少，啟動(dòng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，不僅導(dǎo)致局部組織細(xì)胞的損傷，也阻礙移植到心梗周邊區(qū)BMSCs的遷徙、分化，甚至直接導(dǎo)致移植細(xì)胞凋亡或壞死，從而從根本上限制其移植療效。目前單純BMSCs移植治療心梗遠(yuǎn)期獲益不明顯，而進(jìn)行缺氧、細(xì)胞因子、小分子藥物或基因調(diào)控等預(yù)處理后移植治療能提高植入心臟后BMSCs的存活能力，并產(chǎn)生更好的移植效果。miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控小分子，能夠與靶基因mRNA的3’-UTR結(jié)合，降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯?；谄涮厥獾恼{(diào)控方式，miRNA作為表觀遺傳修飾的靶點(diǎn)有其特有優(yōu)勢(shì)[7]。近年來(lái)，miRNA作為細(xì)胞內(nèi)一類(lèi)重要的調(diào)控分子，已被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[8]。目前已有多個(gè)研究證實(shí)miR-486在調(diào)控癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲及凋亡中發(fā)揮作用并能夠充當(dāng)一些癌癥的生物學(xué)標(biāo)記[9-10]。而關(guān)于miR-486在hMSCs凋亡中的作用迄今尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡過(guò)程中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspases)家族的激活起關(guān)鍵作用，正常細(xì)胞的caspases處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序一旦啟動(dòng)，caspases被激活并隨后發(fā)生凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡。不同的啟動(dòng)性caspase介導(dǎo)不同的凋亡信號(hào)，如caspase-8介導(dǎo)死亡受體相關(guān)信號(hào)，而caspase-9介導(dǎo)線粒體途徑的死亡信號(hào)。雖然在不同細(xì)胞或同一細(xì)胞受不同刺激誘發(fā)凋亡過(guò)程中，caspases的激活不盡相同，但普遍認(rèn)為激活caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。關(guān)于miR-486在氧化應(yīng)激引起hMSCs凋亡中的作用，本研究通過(guò)采用Hoechst染色，流式細(xì)胞術(shù)，caspase-3活性測(cè)定，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及caspase-3酶原測(cè)定等方法，證實(shí)miR-486-5p調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激引起的hMSCs凋亡。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，相比control組，H2O2誘導(dǎo)的hMSCs早期凋亡變化不是很明顯，而加大H2O2濃度刺激后，死細(xì)胞又大量出現(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯示)。這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，可能與MSCs更能耐受H2O2氧化應(yīng)激刺激有關(guān)[11]。

PI3K/Akt通路是蛋白激酶瀑布中的核心成分，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝及凋亡等多種病理生理過(guò)程[12]。Akt修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)拮抗凋亡能力增加，移植入心梗后能增強(qiáng)修復(fù)梗死心肌的能力[13]。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)PI3K/Akt通路中的多種成分都是miR-486的作用靶點(diǎn)，且部分已得到證實(shí)[10, 14]。有證據(jù)表明PI3K/Akt通路在H2O2誘導(dǎo)MSCs凋亡中起重要作用[15-16]，H2O2誘導(dǎo)凋亡并同時(shí)伴Akt活性的下降。本研究通過(guò)Western blotting技術(shù)檢測(cè)Akt蛋白與其磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)Akt磷酸化水平在經(jīng)過(guò)氧化應(yīng)激處理后明顯下降，而阻遏miR-486-5p的作用能抑制氧化應(yīng)激引起的hMSCs凋亡，并且同時(shí)伴隨Akt活性明顯升高，因此推測(cè)其作用可能是通過(guò)增強(qiáng)Akt通路活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。至于miR-486-5p在氧化應(yīng)激介導(dǎo)hMSCs凋亡中的作用靶點(diǎn)及具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，H2O2誘導(dǎo)hMSCs凋亡過(guò)程中miR-486-5p的表達(dá)發(fā)生下降；過(guò)表達(dá)miR-486-5p促進(jìn)氧化應(yīng)激引起的hMSCs凋亡，而阻遏miR-486-5p的作用抑制氧化應(yīng)激條件下的hMSCs凋亡，而且其中作用機(jī)制可能與參與調(diào)控Akt通路有關(guān)。研究結(jié)果為尋找提高移植干細(xì)胞存活能力提供了新的作用靶點(diǎn)，對(duì)于進(jìn)一步的研究具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

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Role of miR-486-5p in apoptosis of human bone marrow mesenchymal stem cells induced by hydrogen peroxide

HU Ming, LI Jiao, LIU Ning-ning, HUANG Zhen-jun, WU Chong-hai, ZHONG Yun, LIU Shi-ming

(TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangzhouInstituteofCardiovascularDisease,Guangzhou510260,China.E-mail:gzliushiming@126.com)

AIM: To investigate the role of microRNA-486-5p (miR-486-5p) in the apoptosis of human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSCs) induced by hydrogen peroxide (H2O2). METHODS: The hMSCs were culturedinvitroand exposed to serum-free medium and H2O2(10 mmol/L). The changes of miR-486-5p expression in oxidative stress-related apoptosis of hMSCs were measured by real-time PCR. The hMSCs were transfected with miR-486-5p mimic or inhibitor at concentration of 30 nmol/L by Lipofectamine RNAiMAX. The effect of miR-486-5p on H2O2-induced decrease in cell viability was evaluated by MTT assay. Hoechst 33342 staining and flow cytometry were applied to determine the role of miR-486-5p in the apoptosis of hMSCs. The protein expression was evaluated by Western blotting. Caspase-3 activity was determined using a caspase-3 activity kit. RESULTS: Compared with control group, the expression of miR-486-5p significantly decreased after treated with H2O2(P<0.05). In addition, over-expression of miR-486-5p in the hMSCs reduced the cell viability, accelerated apoptosis, down-regulated Bcl-2/Bax ratio, caspase-3 enzyme precursor content and phosphorylation of Akt, and activated caspase-3 activity. Conversely, down-regulation of miR-486-5p significantly inhibited H2O2-induced cell apoptosis and the caspase-3 activity, increased cell viability and up-regulated Bcl-2/Bax ratio and phosphorylation level of Akt. CONCLUSION: Over-expression of miR-486-5p promotes H2O2-induced hMSCs apoptosis, and repression of miR-486-5p protects hMSCs from H2O2-induced cellular apoptosis, which may be mediated by regulating Akt signaling pathway.

MicroRNA-486-5p; Mesenchymal stem cells; Oxidative stress; Apoptosis

1000- 4718(2015)03- 0524- 06

2014- 10- 28

2014- 12- 14

廣州市屬高?？蒲许?xiàng)目(No. 2012C230)； 廣東省科技計(jì)劃(No.2013B021800198)； 國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No. 81401156)

△通訊作者 Tel: 020-34153522; E-mail:gzliushiming@126.com

▲并列第1作者

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.024