張 帆， 朱麗花， 王 旭， 陳少華， 楊力建， 吳秀麗， 李 萡， 周 毅， 李揚(yáng)秋,△

( 1廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006； 暨南大學(xué) 2醫(yī)學(xué)院血液病研究所， 3第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 4再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632)

?

系統(tǒng)性紅斑狼瘡中A20表達(dá)特點(diǎn)的研究*

張 帆1,2， 朱麗花3， 王 旭4， 陳少華2， 楊力建2， 吳秀麗2， 李 萡2， 周 毅3， 李揚(yáng)秋2,4△

(1廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006； 暨南大學(xué)2醫(yī)學(xué)院血液病研究所，3第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，4再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632)

目的： 了解系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者外周血中腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(TNFAIP3，也稱A20)、核因子κB(NF-κB)、黏膜相關(guān)淋巴瘤易位基因1(MALT1)及其轉(zhuǎn)錄本1(MALT1V1)的mRNA表達(dá)特點(diǎn)。方法: 采用real-time PCR法檢測21例SLE患者(其中合并硬皮癥2例，合并類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎1例，合并淋巴瘤1例)及31例健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中MALT1、A20、NF-κB和MALT1V1 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果: SLE樣本中，A20 mRNA表達(dá)水平較健康人明顯降低(P<0.01)，MALT1和NF-κB也較健康人降低(P<0.01)。在健康人組，A20和NF-κB mRNA的表達(dá)水平未呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，MALT1和NF-κB則呈正相關(guān)(P<0.05)；而在SLE組中，A20和NF-κB mRNA則顯示出顯著正相關(guān)(P<0.05)，MALT1和NF-κB則不存在相關(guān)性。SLE中MALT1V1表達(dá)量顯著低于正常人(P<0.05)，相關(guān)性研究還顯示，健康人中A20和MALT1V1存在正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，在SLE中則不存在(P>0.05)。結(jié)論: 本研究首先提供了MALT1-A20-NF-κB通路在SLE中的表達(dá)特點(diǎn)。SLE患者異常低表達(dá)A20，這可能與患者低免疫耐受相關(guān)，其與NF-κB表達(dá)的正相關(guān)性情況可能與其它因素的調(diào)控有關(guān)，有待進(jìn)一步證實(shí)。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡; A20; MALT1; NF-κB

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是自身免疫介導(dǎo)、以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病。SLE患者發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，主要表現(xiàn)為自身免疫調(diào)節(jié)紊亂，預(yù)后差。研究表明, 免疫系統(tǒng)失衡在SLE發(fā)病中發(fā)揮了重要作用，從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞活化和促炎因子的增多。免疫系統(tǒng)活化導(dǎo)致靶器官自身免疫復(fù)合物的沉積和組織破壞性T細(xì)胞的滲入，而促炎因子則有助于免疫活化狀態(tài)的維持。

A20，也稱為腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(tumor necrosis factor α-induced protein 3，TNFAIP3)，A20基因定位于染色體6q23.3，其cDNA序列為4 440 bp，其開放讀碼框?yàn)? 370 bp，編碼790氨基酸的90 kD蛋白。A20蛋白在羧基末端含有7 個(gè)Cys2-Cys2 鋅指(zinc finger，ZnF)基序，是一種新類型的鋅指蛋白，這些鋅指基序是NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用所必須的。而A20 的氨基端則含有一個(gè)基序，稱為卵巢腫瘤基序(ovarian tumor domain，OTU)，具有去泛素化蛋白酶活性作用。因此A20具有腫瘤抑制因子及炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心調(diào)節(jié)因子NF-κB抑制因子的雙重功能[1-4]。它在天然免疫和過繼性免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用，對免疫動(dòng)態(tài)平衡有重要的調(diào)節(jié)作用[5]。A20缺失與炎癥介導(dǎo)的自身免疫性疾病和淋巴細(xì)胞腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[5-6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，A20作為炎癥調(diào)控因子對SLE的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用，A20基因的缺失、突變和甲基化與SLE的發(fā)生關(guān)系密切[7-10]。而黏膜相關(guān)淋巴瘤易位基因1 (mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1，MALT1)是NF-κB信號通路中的一種調(diào)控蛋白，在T細(xì)胞受體(T-cell receptor，TCR)介導(dǎo)的NF-κB的活化和調(diào)控淋巴細(xì)胞增殖和分化的過程中具有重要作用[11- 12]?；驇熨Y料顯示MALT1存在2種轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄本2(MALT1V2)比轉(zhuǎn)錄本1(MALT1V1)缺少 33 個(gè)堿基，但未有2種轉(zhuǎn)錄本在正常人、血液腫瘤和免疫系統(tǒng)疾病中分布特點(diǎn)的報(bào)道。同時(shí)，MALT1作為一種蛋白酶可水解NF-κB負(fù)性調(diào)控因子A20。因此，A20和MALT1有可能在SLE 的發(fā)病中具有一定作用。MALT1在淋巴瘤和白血病中的作用及其與A20關(guān)系已有一定研究，但其在SLE患者中是否扮演一樣的角色還未見報(bào)道。同樣，盡管已發(fā)現(xiàn)A20基因的一些單核苷酸多態(tài)性可能是SLE的易感位點(diǎn)，但A20在SLE患者中的表達(dá)情況研究尚不充分，其調(diào)控機(jī)制也不明確。本研究通過觀察SLE 患者和正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中MALT1、A20和NF-κB mRNA的表達(dá)特點(diǎn)及其與SLE 疾病狀態(tài)的關(guān)系，期望進(jìn)一步了解SLE細(xì)胞異常的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 樣本收集

收集暨南大學(xué)附屬華僑醫(yī)院2008年至2011年確診的SLE患者外周血標(biāo)本21例(其中合并硬皮癥2例，合并類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎1例，合并彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤1例，無合并癥17例)，另收集31例健康人外周血標(biāo)本作為對照組。

2 方法

2.1 RNA提取及cDNA合成 RNA提取采用TRIzol試劑盒(Invitrogen)提取RNA。另外，采用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒( BD)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第1鏈;用RT-PCR 檢測β2-微球蛋白(β2-microglobulin, β2M)mRNA的表達(dá)情況以檢驗(yàn)所合成cDNA 的質(zhì)量。

2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)MALT1基因(Accession No: NM_006785, NM_173844),A20基因 (Accession No: NM_006290) 和NF-κB基因設(shè)計(jì)，引物均由上海英濰捷基有限公司合成。以β2M作為內(nèi)參照設(shè)計(jì)上、下游引物，各引物序列見表1[13]。

表1 Real-time PCR使用的引物

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 利用SYBR GreenⅠ染料進(jìn)行各基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，擴(kuò)增總反應(yīng)體系為20 μL，應(yīng)用Real Master Mix試劑盒(Tiangen)，其中包括2×Real Mastr Mix 10 μL、10 mmol/L上、下游引物0.5 μL 以及1 μL cDNA。每1個(gè)標(biāo)本均設(shè)復(fù)孔，每1個(gè)基因均設(shè)1個(gè)陰性對照孔。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 min后，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，每一循環(huán)包括95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s。隨后,以0.17 ℃/s變化速度從55 ℃到95 ℃，每隔2 s記錄1次熒光值,獲得熔解曲線。反應(yīng)在CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad)中進(jìn)行[14]。

2.4 mRNA表達(dá)水平的計(jì)算方法 采用相對定量法分別分析SLE患者和健康人外周血細(xì)胞中MALT1、A20、NF-κB mRNA表達(dá)水平的差異，以β2M為內(nèi)參照，利用Ct值，計(jì)算SLE患者和健康人各基因的相對表達(dá)量。相對定量法的計(jì)算公式為2-ΔΔCt[15]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析 SLE組和健康人組A20/MALT1/NF-κB mRNA，檢測數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，各組mRNA表達(dá)水平比較采用秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon)，并采用Pearson’s correlation進(jìn)行相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MALT1、A20和NF-κB mRNA在SLE中的表達(dá)水平

Real-time PCR結(jié)果顯示，SLE組和健康對照組樣本均表達(dá)MALT1、A20和NF-κB mRNA，在健康對照組中，各樣本之間MALT1、A20和NF-κB的表達(dá)水平比較接近，在SLE患者中3種mRNA的表達(dá)水平差異較大，應(yīng)用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在SLE患者中，A20的表達(dá)水平顯著低于健康對照組(P<0.01)，MALT1表達(dá)水平低于健康對照組(P<0.01)，NF-κB的表達(dá)水平較健康對照組也明顯減低(P<0.05)。根據(jù)其表達(dá)水平特點(diǎn)，分為高表達(dá)和低表達(dá)2組(P<0.01)；此外，根據(jù)SLE合并其它疾病與否分為2組，合并其它疾病組4例，均為A20低表達(dá)(P<0.01)，見表2。

表2 健康對照和SLE組中A20、MALT1和NF-κB mRNA的相對表達(dá)水平

HI: healthy individuals.**P<0.01vsHI.

另外，我們還分別分析A20高或低表達(dá)組及有無合并癥組樣本mRNA的表達(dá)水平差異，結(jié)果顯示這些組間并無顯著差異(P>0.05)。

2 SLE中MALT1兩種轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)特點(diǎn)

根據(jù)NCBI基因庫報(bào)道，MALT1有2種轉(zhuǎn)錄本，兩者的表達(dá)水平在不同細(xì)胞和疾病中存在差異[16-17]。本研究分別檢測同時(shí)含有2種MALT1轉(zhuǎn)錄本和僅含MALT1轉(zhuǎn)錄本1的PCR產(chǎn)物[16]，通過MALT1V1/MALT1可間接得出HALT1V2表達(dá)量。進(jìn)一步比較正常人、SLE樣本中MALT1兩種轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)情況，結(jié)果可見，所有樣本均表達(dá)2種轉(zhuǎn)錄本，在正常人和SLE的大多數(shù)樣本中MALT1V2比MALT1V1表達(dá)量要高。SLE組的MALT1V1表達(dá)量與正常人比較顯著降低(P<0.05)。MALT1V1/MALT1百分比表達(dá)稍高于正常人，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 健康人和SLE中MALT1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本相對表達(dá)情況

HI: healthy individuals.*P<0.05vsHI.

3 SLE中A20、NF-κB和MALT1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平相關(guān)性

理論上，MALT1-A20-NF-κB信號分子的表達(dá)水平之間應(yīng)存在一定的相關(guān)性，在健康對照組中，可以發(fā)現(xiàn)MALT1和NF-κB的表達(dá)水平呈現(xiàn)正相關(guān)(P<0.05)，見圖1。MALT1V1、MALT1V1/MALT1百分比和A20呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見圖2、3。而MALT1和A20，A20和NF-κB表達(dá)水平之間無顯著的相關(guān)性(P>0.05)。在SLE患者組中，A20和NF-κB則存在明顯正相關(guān)(P<0.01)，見圖1。而MALT1和A20、MALT1和NF-κB則不存在明顯相關(guān)性(P>0.05)。

Figure 1.Correlations between NF-κB expression and A20 or MALT1V1 in healthy group and SLE group.

Figure 2.Correlations between expression of A20 and MALT1V1 in healthy group and SLE group.

Figure 3.Correlations between expression of A20 and MALT1V1 in healthy group and SLE group.

討 論

SLE是一種涉及多個(gè)免疫調(diào)節(jié)基因功能異常的慢性炎癥性疾病。而A20基因在負(fù)性免疫調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。我們的研究結(jié)果顯示在SLE中A20基因表達(dá)明顯降低，而NF-κB、MALT1基因表達(dá)也存在下調(diào)趨勢。SLE患者中A20與NF-κB基因的表達(dá)顯示明顯正相關(guān)，而MALT1與NF-κB、A20和MALT1V1、MALT1V1/MALT1百分比的正相關(guān)關(guān)系則被打破。國內(nèi)外研究表明，A20是NF-κB的負(fù)調(diào)控因子，但本研究結(jié)果卻顯示在SLE中，兩者呈正相關(guān)關(guān)系，這可能與NF-κB同時(shí)接受其它因素的調(diào)控有關(guān)。在正常人中因MALT1(本研究結(jié)果提示主要為MALT1V1調(diào)控作用)對A20具有水解酶作用，MALT1間接調(diào)控NF-κB改變，從而影響T細(xì)胞的活化和增殖，形成了精密的MALT1-A20-NF-κB信號調(diào)節(jié)途徑。然而在SLE中，MALT1并未見到對A20有抑制作用，從而失去了對NF-κB的調(diào)控能力。我們推測，其它異常因素的調(diào)控使得A20雖在mRNA水平表達(dá)下降，卻仍然出現(xiàn)了NF-κB表達(dá)下降，T細(xì)胞免疫功能也受到抑制。而MALT1和MALT1V1降低這一現(xiàn)象可能是由于A20表達(dá)下降后使對A20具有降解作用的MALT1反饋性降低引起，而它是否與SLE病程和治療情況有關(guān)尚待進(jìn)一步研究。我們在多發(fā)性骨髓瘤病人中，也發(fā)現(xiàn)類似的改變特點(diǎn)[18]，提示NF-κB表達(dá)可能涉及多重調(diào)控。本文首次報(bào)道了SLE中A20的調(diào)控因素MALT1的表達(dá)特點(diǎn)，分析了其2個(gè)轉(zhuǎn)錄本的分布情況。健康人A20和MALT1V1存在的負(fù)相關(guān)關(guān)系在SLE患者中被打破，這可能由于A20功能異?；騇ALT1V1之外的其它調(diào)控因素作用的結(jié)果，但由于尚未有其它研究報(bào)道SLE中MALT1的改變特點(diǎn)，2個(gè)轉(zhuǎn)錄本的功能也不明確，尚需做進(jìn)一步研究。

根據(jù)目前研究，A20表達(dá)異常導(dǎo)致SLE的病理機(jī)制可歸納為以下幾方面：(1)A20的低表達(dá)造成自身反應(yīng)性T細(xì)胞過度活化，這是SLE的關(guān)鍵致病因素。A20通過去泛素化MALT1擾亂TCR信號向NF-κB的傳遞，從而抑制T細(xì)胞的活化[19]，進(jìn)而引起組織器官損害；(2)A20的降低增強(qiáng)了自身免疫復(fù)合物的沉積，這也是SLE的重要特點(diǎn)。A20阻礙了B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的生成和活化[20-21]。A20在B細(xì)胞中的缺失增加了B細(xì)胞的增殖和自身抗體的生成[22]。因此，A20 的低表達(dá)導(dǎo)致B細(xì)胞的過度活化和自身抗體的聚積；(3)A20的低表達(dá)促使IL-4 、IL-6、TNF-α和IFN-γ等促炎癥因子的血清水平升高，這是SLE的另一個(gè)特性[23-24]。A20缺失小鼠血清中含高水平的炎癥細(xì)胞因子，并表現(xiàn)為持續(xù)性的NF-κB活化和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的TNF-α[25]。A20在RA和其它自身免疫性疾病中的低表達(dá)同樣證明這一機(jī)制[26-27]?？傊?，由于通常情況下A20對多種免疫細(xì)胞的活化具有調(diào)控作用，而當(dāng)A20表達(dá)降低時(shí)可引起異常的免疫應(yīng)答，是SLE發(fā)生中的一個(gè)重要因素。而造成A20低表達(dá)原因可能與調(diào)控A20的上游分子如MALT1，以及A20基因的突變、缺失或啟動(dòng)子甲基化等相關(guān)[10, 28]，至于在本研究中SLE病人樣本A20基因是否同樣存在基因突變等，還有待后續(xù)的研究。

總之，在本研究中，我們首次報(bào)道了SLE中MALT1- A20-NF-κB表達(dá)模式的特點(diǎn)和MALT1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的分布情況?？偟膩碚f，SLE患者出現(xiàn)了A20的低表達(dá)和功能異常，而SLE的發(fā)生提示NF-κB可能受除A20以外的其它因素調(diào)節(jié)或A20存在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，其可能與疾病的緩解和治療有關(guān)。此外，我們的研究僅限于real-time PCR方法檢測mRNA水平表達(dá)，蛋白定量和機(jī)理的闡明還有待下一步的研究，并期望能明確T細(xì)胞中A20、MALT1V1和MALT1V2的功能及其與SLE疾病轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性。

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Expression of A20 in patients with systemic lupus erythematosus

ZHANG Fan1, 2, ZHU Li-hua3, WANG Xu4, CHEN Shao-hua2, YANG Li-jian2, WU Xiu-li2, LI Bo2, ZHOU Yi3, LI Yang-qiu2, 4

(1GuangdongProvincialKeyLaboratoryofBiotechnologyCandidateDrugResearch,CollegeofLifeScienceandBio-pharmacopedics,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;2InstituteofHematology,SchoolofMedicine,3DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospital,4ChinaKeyLaboratoryforRegenerativeMedicineofMinistryofEducation,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:jnyangqiuli@163.com)

AIM: To investigate the expression and regulation of A20 in healthy individuals and the patients with systemic lupus erythematosus (SLE). METHODS: The expression levels of A20, NF-κB, MALT1, and MALT1V1 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of the patients with SLE (including 2 cases with scleroderma, 1 case with rheumatoid arthritis, and 1 case with lymphoma) were analyzed by real-time PCR. RESULTS: A significantly lower A20 expression level was found in the PBMC from SLE group compared with the healthy controls, while the expression levels of MALT1 and NF-κB were also decreased. In addition, no significant correlation between A20 and NF-κB expression levels in healthy group was observed, but a positive correlation was found in SLE group (P<0.05). A significant positive correlation between MALT1 and NF-κB expression levels in healthy group (P<0.05) was observed, and no significant correlation was found in SLE group. The expression level of MALT1V1 in SLE group was significantly lower than that in healthy control group, and there was a positive correlation between A20 and MALT1V1 in healthy volunteers (P<0.01), but that did not exist in SLE group. CONCLUSION: The characteristics of the expression pattern of MALT1-A20-NF-κB in the SLE patients were presented. Lower level of A20 expression was found in the SLE patients, in particular with other autoimmune disease or lymphomas, indicating the lower immune tolerance in SLE. The positive correlation of A20 and NF-κB may relate to positive regulation of MALT1.

Systemic lupus erythematosus; A20; MALT1; NF-κB

1000- 4718(2015)03- 0518- 06

2014- 08- 06

2015- 01- 20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 91129720)

△通訊作者 Tel: 020-85226877; E-mail: jnyangqiuli@163.com

R363.2； R593.24+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.023