吳建華， 杜銀香， 黃 強△

(湖北民族學院 1附屬民大醫(yī)院泌尿外科, 2醫(yī)學院， 湖北 恩施 445000)

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刺五加苷B/E對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞增殖及TGF-β1和PPARγ表達的影響*

吳建華1， 杜銀香2， 黃 強1△

(湖北民族學院1附屬民大醫(yī)院泌尿外科,2醫(yī)學院， 湖北 恩施 445000)

目的： 探討刺五加苷B/E(ETS-B/E)對高糖環(huán)境大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1增殖的影響及機制。方法: 進行HBZY-1細胞傳代、無菌培養(yǎng)，選生長良好的第4代HBZY-1細胞，測定高糖(25 mmol/L)環(huán)境下符合生長規(guī)律曲線圖的細胞密度。然后接種6組，分成低糖組(LG)、高糖組(HG)、高糖ETS-B/E(低劑量、中劑量、高劑量)組和高糖洛沙坦組(LTG)。予以相應藥物干預后，測定在24 h、48 h和72 h時，其對HBZY-1細胞生長的抑制作用和抑制率，并用免疫細胞化學和Western blotting檢測各組增殖過程中TGF-β1和PPARγ的表達情況。結果: HBZY-1細胞的接種濃度為每孔2 000個時，符合細胞生長基本規(guī)律，高糖顯著促進HBZY-1細胞的增殖。ETS-B/E作用下，在各時點，對HBZY-1細胞的抑制作用和抑制率與HG有顯著差異(P<0.05)；免疫細胞化學和Western blotting分析均顯示，ETS-B/E能顯著抑制TGF-β1表達和促進PPARγ表達(P<0.05)，且ETS-E顯著強于ETS-B(P<0.05)，呈濃度和時間依賴性趨勢。結論: ETS-B/E對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞的增殖具有顯著抑制作用，其作用機制與阻止TGF-β1的表達和促進PPARγ的表達相關。

刺五加苷B/E； 腎小球系膜細胞； 轉化生長因子β1； 過氧化物酶體增殖物激活受體γ

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)已成為直接影響人類生活質量和危害人類健康的主要疾病之一。有研究證實，非諾貝特聯(lián)合刺五加注射液治療糖尿病性CRF，患者隨著血清腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)的減少而逐漸呈現(xiàn)明顯腎功能改善趨勢[1]。另有研究證實，刺五加提取物能直接抑制腎小球入球和出球小動脈的收縮，改善腎臟微循環(huán)，阻止或逆轉腎小球血管重構，減少腎小球血管膠原纖維沉積，增加腎小球血管彈力層，從而抑制入球小動脈玻璃樣變，阻止腎小球纖維化[2]。這種機制與增強腎小球的組織型纖溶酶原激活劑活性，抑制腎小球的纖溶酶原激活物抑制物1活性，降低血內皮素含量和血液黏滯度相關[3]。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，隨著糖尿病發(fā)病率的逐年增加，其已成為CRF的主要原因之一?，F(xiàn)已證實，CRF與高血糖狀態(tài)密切相關外，還與多種細胞因子的分泌紊亂密切相關[1]。臨床實踐證明，一旦發(fā)生CRF，目前沒有有效的逆轉措施，只是通過血液透析或腎移植手術維持生命[2]。因此，有效的藥物預防是阻止糖尿病性CRF的主要手段。本文報道刺五加苷B/E(eleutheroside B/E，ETS-B/E)能顯著抑制腎小球系膜細胞HBZY-1的增殖，這可能與臨床資料顯示其防治CRF相關[4]。

材 料 和 方 法

1 細胞、實驗材料與儀器

大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1(上海通派生物科技有限公司)；高糖(high glucose， LG)和低糖(low glucose， LG)DMEM培養(yǎng)基、雙抗溶液(Gibco)；澳大利亞優(yōu)質胎牛血清(北京博益?zhèn)I(yè)儀器有限公司)；一次性塑料培養(yǎng)瓶(Costar)；噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(上海譜振生物科技有限公司)；含EDTA胰酶溶液(廣州偉伯化工有限公司)；刺五加苷B/E(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司)；氯沙坦鉀片(losartan，LT)(杭州默沙東制藥有限公司)；兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗體、SABC-F兔抗大鼠IgG免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒及兔抗大鼠過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor, PPARγ)(武漢博士德生物工程有限公司)；羊抗兔 II 抗，羊抗大鼠 II 抗(Proteintechm)；Trizol試劑(Dako)；超靈敏ECL發(fā)光試劑盒(北京優(yōu)劑生物科技有限公司)；BD Falcon U型不同孔數(shù)細胞培養(yǎng)板(Millipore)。

BB16UV和BB5060UV型恒溫CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)；DZF-6210實驗室真空干燥箱、KH-700DE型數(shù)控超聲波清洗器(Millipore)；SW-CJ-1CU超凈工作臺(上海巴玖實業(yè)有限公司)；XL90型超速低溫離心機(北京北加美因生物技術有限公司)；TG1850-WS高速冰凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；梅特勒ML104電子天平(Precisa)；CKX41倒置顯微鏡(Olympus)；顯微圖像分析系統(tǒng)(日本平澤制作所)；PCR 儀、電泳儀及電泳槽(Bio-Rad)；恒溫振蕩器和恒溫搖床(Eppendorf)。

2 主要藥物的配制

稱取氯沙坦鉀片 46 mg，加入DMSO 1 mL充分溶解，于-20 ℃保存?zhèn)溆?，使用時以高糖完全培養(yǎng)基稀釋成相應濃度。分別稱取ETS-B和ETS-E各44.6 mg，加入DMSO 1 mL充分溶解，于-20 ℃保存?zhèn)溆茫褂脮r以高糖完全培養(yǎng)基稀釋成相應濃度。

3 實驗方法

3.1 HBZY-1培養(yǎng)與鑒定 37 ℃水浴箱輕搖振蕩復蘇HBZY-1，吸取細胞懸液移入離心管，加入3～4 mL 10%胎牛血清細胞培養(yǎng)液，混勻離心5 min(1 000 r/min)，棄上清；再加入適量細胞培養(yǎng)液，移入細胞培養(yǎng)瓶，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h；至80%細胞融合時進行細胞傳代，吸去培養(yǎng)液，用PBS液沖洗3次，加入0.8 mL 0.25%胰蛋白酶消化2～3 min(鏡下觀察細胞形態(tài)變?yōu)閳A球形、間隙增大、胞質回縮)，加入胎牛血清培養(yǎng)液終止消化；吸去培養(yǎng)液，輕吹制成細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，再加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，傳代至第5代。

于倒置顯微鏡下觀察，生長活躍的HBZY-1細胞呈貼壁生長，體積較大，形狀為梭形、不規(guī)則星形、三角形或樹枝形，細胞質向外伸出多個大小不等的突起，中央的卵圓形核清晰可見。

3.2 實驗分組 選生長良好(鏡下生長均勻、外形緊湊、透光性好、折光性強、輪廓清、胞漿體積小、胞漿顆粒狀少)的第4代HBZY-1細胞，接種于6孔板，加蓋玻片，設置2個對照孔后分成低糖組(LG，5.5 mmol/L)、高糖組(HG，25 mmol/L)、ETS-B/E低劑量組(ETS-B/E-L，HG 25 mmol/L+ETS-B/E 25 μmol/L)、ETS-B/E中劑量組(ETS-B/E-M，HG 25 mmol/L+ETS-B/E 50 μmol/L)、ETS-B/E高劑量組(ETS-B/E-H，HG 25 mmol/L+ETS-B/E 100 μmol/L)和LT陽性對照組(LTG，HG 25 mmol/L+LT 10 μmol/L)。

3.3 HBZY-1生長曲線的測定 待各組HBZY-1細胞達80%融合時，經胰酶常規(guī)消化制成細胞混懸液。以含10% 胎牛血清的低糖完全培養(yǎng)液將細胞濃度調整為2、5、10×107/L共3個濃度，并進行細胞計數(shù)。于96孔板各孔中加入100 μL細胞混懸液(終濃度每孔為2 000、5 000和10 000個)，各濃度設置18個復孔，邊緣以PBS封閉。通以5% CO2、37 ℃分別恒溫培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h(培養(yǎng)較久的中途換液)后，各自加入20 μL MTT，通5% CO2、37 ℃恒溫孵育4 h，去MTT液，各孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，以酶標儀觀察記錄吸光度A值(波長492 nm，A1孔作為調零孔)，繪出HBZY-1細胞的生長曲線，得出168 h內的最佳接種濃度。據(jù)GMC生長曲線進行細胞增殖實驗檢測。待細胞生長達80%融合時經胰酶消化處理成細胞混懸液。以含10%胎牛血清的低糖培養(yǎng)液調整濃度為2×107/L，進行細胞計數(shù)后，96孔板中每孔(設6個復孔)加入細胞混懸液100 μL，周邊以PBS封閉，通5% CO2、37 ℃恒溫孵育24 h。細胞貼壁24 h后去上清，分別于24 h、48 h、72 h加入100 μL無血清DMEM/F12培養(yǎng)液各自培養(yǎng)24 h，細胞同步于G0期后，去上清，按分組予以刺激。

×100%， 抑制率(%)=100%-存活率。

3.4 免疫細胞化學法檢測TGF-β1和PPARγ的表達 經胰酶常規(guī)消化制成的各組細胞混懸液，于6孔板中用一次性塑料吸管吸取PBS輕洗3次，風干，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，蒸餾水輕洗3次。室溫浸泡固定玻片20 min(固定液用30% H2O2與純甲醇按1∶ 50配比)，滴加5% BSA封閉液孵育20 min，再分別滴加相應的 I 抗兔IgG稀釋液后，于4 ℃冰箱放置24 h，以PBS輕洗3次，分別滴加相應的生物素化兔抗大鼠IgG，恒溫37 ℃孵育20 min，PBS輕洗3次。再滴加SABC，恒溫37 ℃孵育20 min，PBS輕洗4次，以DAB顯色試劑盒對處理的各組玻片予以室溫顯色20 min(鏡下控制反應時間)，蒸餾水洗滌。甩干玻片，蘇木素復染，分別以不同濃度二甲苯和乙醇脫水，透明化處理后樹膠封片，鏡下觀察。

3.5 圖像分析 置DAB顯色玻片于光學顯微鏡下，將圖像經物鏡輸入攝像機，以圖像分析系統(tǒng)定量分析各組的表達情況。選擇14個視野測定吸光度，同一光強度下測定每張玻片均值。用SPSS 11.0軟件行配對t檢驗，比較各組平均積分吸光度(integral absorbance，IA)。

3.6 Western blotting法檢測TGF-β1和PPARγ的蛋白表達 細胞培養(yǎng)于葡萄糖或藥物刺激結束后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入100 μL RIPA裂解細胞30 min、將裂解液4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清與等量待測樣品混合，100 ℃加熱5 min，以12% SDS-PAGE后轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，用1×TBST洗滌3次，加入 I 抗4 ℃孵育24 h，再以1×TBST洗滌3次，加入 II抗孵育1 h，1×TBST洗滌3次，用BCA法進行蛋白定量。

4 統(tǒng)計學處理

相同條件下每組實驗重復6次，所有數(shù)據(jù)用SPSS 11.0軟件處理。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較使用 Dunnett-t檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 HBZY-1細胞正常生長曲線的測定

結果顯示，HBZY-1細胞接種濃度為10 000 cells/well時，24 h～48 h為倍增期，48 h～72 h為平臺期，72 h之后進入衰亡期；HBZY-1細胞接種濃度為5 000 cells/well時，24 h～48 h為倍增期，隨之進入緩慢增殖期，至96 h達增殖高峰后迅速進入衰亡期；HBZY-1細胞接種濃度為2 000 cells/well時，24 h～48 h為潛伏期(緩慢增殖期)，48 h～72 h為倍增期，72 h～120 h達平臺期，120 h后進入衰亡期。由生長曲線圖發(fā)現(xiàn)，HBZY-1接種濃度為2 000 cells/well時，其生長曲線圖接近“S”形，符合細胞生長的基本規(guī)律，見圖1。

Figure 1.The growth curves of the HBZY-1 cells cultured with different cell densities determined by MTT assay. Mean±SD. n=6.

2 ETS-B/E對高糖濃度環(huán)境下HBZY-1細胞生長的抑制作用

結果顯示，各組A值隨時間延長顯著增高，且各個時點的A值HG組均高于LG組(P<0.05)；24 h時，LTG組與HG組無顯著差異(P>0.05)，其余各組與HG組具有顯著差異(P<0.05)；在同一時點，ETS-B-M組和ETS-B-H組的A值分別顯著低于ETS-E-M組和ETS-E-H組(P<0.05)，ETS-B-H組和ETS-E-H組的A值顯著低于LTG組(P<0.05)；ETS-B/E各不同劑量組的抑制率顯著大于LTG組，而ETS-E又顯著大于ETS-B(P<0.05)，見表1、圖2。

表1 ETS-B/E對HBZY-1細胞生長的影響

*P<0.05vsLG at the same time point;△P<0.05vsHG at the same time point;▲P<0.05vsETS-B/E-L at the same time point;#P<0.05vsthe same concentration of EST-B at the same time point.

Figure 2.The effects of ETS-B/E on the inhibitory rate of HBZY-1 cells cultured with high glucose at different time points. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs ETS-B-H; #P<0.05 vs ETS-B-M and ETS-B-L at the same time point; ▲P<0.05 vs ETS-B/E at the same time poimt.

3 免疫細胞化學法檢測EST-B/E對TGF-β1和PPARγ表達的影響

免疫細胞化學法檢測結果顯示，不同濃度ETS作用下TGF-β1 的平均吸光度顯著低于HG組(P<0.05)，而且隨著濃度梯度的增加而顯著降低，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴趨勢。結果還發(fā)現(xiàn)，在同一濃度狀態(tài)下，ETS-E顯著低于ETS-B (P<0.05)，并呈現(xiàn)濃度依賴趨勢；在同一濃度狀態(tài)下，ETS-E顯著高于ETS-B (P<0.05)，不同濃度ETS-B/E作用下，TGF-β1的表達與劑量呈現(xiàn)明顯的負相關趨勢(P<0.05)。而在不同濃度ETS-B/E作用下，PPARγ的表達與劑量呈現(xiàn)明顯的正相關趨勢(P<0.05)，見圖3、4和表2、3。

4 Western blotting法檢測EST-B/E對TGF-β1和PPARγ蛋白表達的影響

TGF-β1蛋白電泳條帶膠片感光定性分析顯示，ETS-B/E組顯著弱于HG組，且隨濃度的增加而逐漸減弱；而檢測PPARγ的Western blotting圖顯示，ETS-B/E組顯著強于HG組，且隨濃度的增加而逐漸增強；蛋白電泳條帶定量分析顯示，HG組的TGF-β1蛋白表達量顯著高于各個濃度的ETS-B/E組，且隨ETS-B/E濃度的增加，其表達量逐漸降低(P<0.05)；而HG組的PPARγ蛋白表達量顯著低于各個濃度的ETS-B/E組，且隨其濃度的增加，其表達量逐漸升高(P<0.05)，且同一濃度的ETS-E顯著強于ETS-B(P<0.05)。表明ETS-B/E能顯著抑制TGF-β1蛋白表達而促進PPARγ蛋白表達，見圖5。

Figure 3.The effects of ETS-B/E at different concentrations on the expression of TGF-β1 and PPAR-γ in the HBZY-1 cells cultured with high glucose determined by immunocytochemical method. Mean±SD. n=6.

討 論

高糖是引起腎小球肥大，導致糖尿病腎病的始動因素，也是導致慢性腎衰竭的重要原因[3]。HBZY-1 細胞是腎小球內非?；钴S的細胞，主要生理功能是吞噬和處理腎小球濾過膜的免疫復合物和大分子蛋白質，維持濾過膜的通透性，發(fā)揮著單核-巨噬細胞樣功能；合成與分泌細胞外基質，維系腎小球毛細血管網結構的完整性；收縮或舒張腎小球血管，調節(jié)腎小球血流量和濾過率；分泌多種細胞因子或生長因子(TGF-β1、PDGF、TNF-α及renin等)，維持腎臟功能[5]。其病變與腎功能損傷、衰竭密切相關，腎小球系膜細胞的過度增生是腎病引起腎小球肥大、細胞外基質增多和腎小球硬化的最突出的病理變化[6]。

本研究顯示，在高糖環(huán)境下，HBZY-1細胞接種濃度為2 000 cells/well 時，其生長曲線圖接近“S”形，能較準確反映出 HBZY-1 細胞生長的基本規(guī)律，表明高糖環(huán)境下能促進腎小球系膜細胞從靜止型細胞轉化為分泌或增殖型細胞[7]。因此，在此條件下，可以作為細胞生物學特性的基本參數(shù)，能客觀地反映ETS-B/E干預的時間、條件及有效性。由于高糖可對腎小球系膜細胞增殖的調節(jié)具有雙向性(早期促進細胞增殖，72 h后抑制細胞增殖)[6-7]。故此，本實驗檢測HBZY-1細胞不同時點的A值只截止至72 h。

Figure 4.The effects of ETS-B/E at concentration of 100 μmol/L on the expression of TGF-β1 and PPARγ in the HBZY-1 cells cultured with high glucose determined by immunocytochemical method.

實驗證實，ETS-B/E對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞的生長和增殖率均有顯著的抑制作用，高劑量ETS-B/E的A值顯著低于洛沙坦，但不同劑量組的抑制率顯著大于洛沙坦，且這種抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量和濃度依賴性，其中ETS-E顯著強于ETS-B。表明ETS-B/E對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞的生長和增殖呈現(xiàn)劑量和濃度依賴性抑制作用，但這種抑制作用弱于洛沙坦，其中ETS-E強于ETS-B。有報道證實，ETS-B/E作用靶點就是腎小球系膜細胞，能直接擴張腎臟血管，改善腎臟微循環(huán)，減輕腎臟慢性缺血[8]；另有報道，刺五加醇提取物能減少腎小球膠原纖維沉積和彈力層斷裂，減輕腎血管增生，阻止腎小球血管發(fā)生玻璃樣變，避免腎小球纖維化形成[9]。這些效應與本實驗結果相一致，結合本研究內容分析，其作用機制可能如下。

表2 免疫細胞化學法檢測不同濃度ETS-B/E對TGF-β1表達的影響

*P<0.05vsHG;△P<0.05vs100 μmol/L of the same group;▲P<0.05vsthe same concentration of ETS-B.

表3 免疫細胞化學法檢測不同濃度ETS-B/E對PPARγ表達的影響

*P<0.05vsHG;△P<0.05vs100 μmol/L of the same group;▲P<0.05vsthe same concentration of ETS-B.

Figure 5.The effects of ETS-B/E at different concentrations on the protein levels of TGF-β1 and PPAR-γ in the HBZY-1 cells cultured with high glucose determined by Western blotting. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs HG; #P<0.05 vs ETS-B.

免疫細胞化學法檢測結果顯示，不同濃度ETS-B/E作用下，TGF-β1的表達與劑量呈現(xiàn)明顯的負相關趨勢。Western blotting檢測結果顯示，TGF-β1蛋白電泳條帶膠片感光定性和定量分析均呈現(xiàn)，高糖時TGF-β1蛋白表達顯著增強，而ETS-B/E作用后，TGF-β1蛋白表達顯著減弱，并顯示為濃度依賴性。這些均表明ETS-B/E抑制高糖環(huán)境下HBZY-1細胞生長和增殖與抑制TGF-β1蛋白表達有關。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖和TGF-β1的作用能導致HBZY-1肥大和外基質合成增多而蓄積，最終導致腎小球硬化。雖其信號通路機制目前尚未完全清楚，但已經清楚增殖性腎小球疾病中，與HBZY-1細胞從靜止型細胞轉化為分泌或增殖型細胞的表型轉化密切相關[5]。而組織學研究證明，HBZY-1細胞與血管平滑肌細胞為同源細胞，在胚胎時期，HBZY-1細胞活躍增殖，合成細胞外基質，并產生多種重要細胞因子，促進腎小球的形成，體內成熟的HBZY-1細胞更替緩慢，稱為靜止型HBZY-1。若在高糖或TGF-β1的刺激下，可從靜止型轉化為分泌或增殖型，從而重新表達血管平滑肌肌動蛋白，進行腎小球的自我修復，若過度表達就可能使腎小球細胞外基質蓄積，最終造成腎小球硬化而誘發(fā)腎病[4, 6]。這表明ETS-B/E抑制高糖環(huán)境下HBZY-1細胞生長和增殖與阻止TGF-β1蛋白表達密切相關。

免疫細胞化學法檢測結果顯示，不同濃度ETS-B/E作用下，PPARγ的光密度表達與劑量呈現(xiàn)明顯的正相關趨勢；Western blotting檢測結果顯示，PPARγ蛋白電泳條帶膠片感光定性和定量分析均呈現(xiàn)高糖時PPARγ蛋白表達顯著減弱，而ETS-B/E作用后，PPARγ蛋白表達顯著增強，并顯示為濃度依賴性。這些均表明ETS-B/E阻止高糖環(huán)境下HBZY-1細胞生長和增殖與促進PPARγ蛋白表達有關。有研究表明，PPARγ系核激素受體超家族成員的一個亞型，是調節(jié)脂肪細胞分化和能量代謝的關鍵性轉錄因子[9]。HBZY-1細胞與血管平滑肌細胞都起源于間葉組織，生物學特征相似。腎病的基本病理變化是細胞外基質增多，導致腎小球毛細血管腔狹窄或閉塞，其病理與血管平滑肌細胞介導的動脈粥樣硬化相似[1]。有研究證實，PPARγ具有抑制HBZY-1細胞的增殖作用，其信號途徑是延長HBZY-1細胞周期中G1期到S期進程，或使周期素依賴性蛋白激酶抑制因子P27下調和P21上調[1, 4]；PPARγ配體通過抑制DAG-PKC-ERK信號途徑和AP-1的活化而抑制TGF-β1的表達，從而發(fā)揮阻止細胞外基質積聚、腎小球纖維化的作用[10]。另有報道，PPARγ拮抗AP-1和NF-κB活性，進而抑制PAI-1轉錄，阻止HBZY-1細胞基質聚積[9]。亦有研究提示，PPARγ可激活HGF，抑制Smad3核轉移而阻止HBZY-1細胞增殖，同時下調TGF-β1和 PAI-1表達，達到延緩腎小球硬化[8]。這些證據(jù)直接說明，PPARγ是阻止HBZY-1細胞生長和增殖的重要信號途徑，間接表明ETS-B/E阻止HBZY-1細胞生長和增殖與促進PPARγ表達相關。

總之，ETS-B/E能有效阻止HBZY-1生長和增殖，其作用機制與抑制TGF-β1的過度表達，同時促進PPARγ的表達密切相關。ETS為刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr．et Maxim) Harms根或莖提取物的總苷成分，系刺五加的主要活性成分[10-11]。ETS包括ETS-/B/C/D/E，占干藥材的0.6%～1.5%，其中ETS-B/E為主要成分占總苷40%～60%[9, 11]。有可能成為預防或阻止腎病患者腎小球硬化、玻璃樣病變、纖維化等病變的有效輔助藥物。

[1] 熊 艷．PPARα激動劑非諾貝特抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖及細胞外基質產生的機制探討[D].武漢：華中科技大學，2011:13-56．

[2] Olukman M, Sezer ED, Ulker S, et al. Fenofibrate treatment enhances antioxidant status and attenuates endothelial dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Exp Diabetes Res, 2010, 2010:828531.

[3] Hou XY, Shen YH, Li CB, et al. PPARα agonist fenofibrate protects the kidney from hypertensive injury in spontaneously hypertensive rats via inhibition of oxidative stress and MAPK activity[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 394(3):653-659.

[4] 鄭 京，梁文娜，邵 丹．刺五加注射液對慢性腎小球腎炎患者血t-PA、PAI-1 變化的影響[J]. 中國中西醫(yī)結合腎病雜志, 2007, 8(9):537-539.

[5] 趙 平．黃芩苷下調NF-κB表達抑制高糖環(huán)境下腎小球系膜細胞增殖的研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2012.

[6] 蘇 寧，趙 平，佘燕玲，等．黃芩苷對糖尿病腎病大鼠足細胞損傷的修復作用研究[J]．中醫(yī)學報，2011，7(26):803-805.

[7] Huang WP, Yin WH, Chen JW, et al. Fenofibrate attenuates endothelial monocyte adhesion in chronic heart failure：aninvitrostudy[J]. Eur J Clin Invest, 2009, 39(9):775-783.

[8] 李 赫，王東亮，趙洪文．羅格列酮通過激活PPARγ改善肺動脈高壓大鼠肺動脈內皮依賴性舒張功能[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(3):549-553.

[9] 杜 娟，徐學明．刺五加注射液對糖尿病腎病慢性腎衰竭患者血清腫瘤壞死因子水平的影響[J]. 中國中西醫(yī)結合腎病雜志, 2003, 4(1):42-43.

[10]元紅花，程 琳，許妍姬. 刺五加皂苷對Aβ25-35誘發(fā)PC12細胞毒性及細胞凋亡的保護作用[J]. 中國老年學雜志, 2014, 34(3):1570-1576.

[11]Huang DB, Hu ZH, Yu ZF. Eleutheroside B or E enhances learing and memory in experimentally aged rats[J]. Neural Regen Res, 2013, 8(12):1061-1070.

Effect of eleutheroside B/E on proliferation and expression of PPARγ and TGF-β1 in HBZY-1 cells cultured with high glucose

WU Jian-hua1, DU Yin-xiang2, HUANG Qiang1

(1DepartmentofUrology,AffiliatedHospital，2MedicalSchool，HubeiUniversityforNationalities,Enshi445000,China.E-mail: 1720482539@qq.com)

AIM: To explore the effects and mechanism of eleutheroside (ETS) B or E on the proliferation of HBZY-1 cells treated with high glucose. METHODS: The HBZY-1 cells were cultured under high glucose condition. The 4th generation of HBZY-1 cells was used for determining the optimal cell density, which was consistent with the growth regulation curve of the cells. The cells were divided into 6 groups: low glucose (LG) group, high glucose (HG) group, high glucose plus ETS-B/E (low dose, medium dose and high dose) groups, and high glucose plus losartan (LTG) group. After all cells were treated with the corresponding drugs at 24 h, 48 h and 72 h, the inhibitory rate of the proliferation was measured, and the expression of TGF-β1 and PPARγ was detected by immunocytochemistry and Western blotting. RESULTS: The best cell density was 2 000 cells/well, which was complied with the basic rules of the cell growth, and high glucose significantly promoted the HBZY-1 cell proliferation. At each time point, the inhibitory effects of ETS-B/E were significantly different between HG group and LTG group on the proliferation of the HBZY-1 cells (P<0.05). The expression of TGF-β1 was significantly inhibited, and the expression of PPARγ was significantly promoted by ETS-B/E (P<0.05). ETS-E showed stronger effect than ETS-B (P<0.05) in a concentration- and time-dependent manner. CONCLUSION: ETS-B/E significantly inhibits the proliferation of HBZY-1 cells under high glucose condition by decreasing TGF-β1 expression and promoting PPARγ expression.

Eleutheroside B/E; Mesangial HBZY-1 cells; Transforming growth factor β1; Peroxisome proli-ferator-activated receptor γ

1000- 4718(2015)03- 0511- 07

2014- 06- 09

2014- 12- 30

湖北省教育廳基金資助項目(No. D20111903)

△通訊作者 Tel: 017-88437479； E-mail: 1720482539@qq.com

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A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.022