齊 潔， 徐 芳， 馬 慧， 崔建國， 張清潭△

(1濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院老年內科，山東 濱州 256603； 2濱州醫(yī)學院病理生理教研室，山東 煙臺 264003)

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阿托伐他汀對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化病變中TRPC5表達的影響*

齊 潔1， 徐 芳2， 馬 慧1， 崔建國1， 張清潭1△

(1濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院老年內科，山東 濱州 256603；2濱州醫(yī)學院病理生理教研室，山東 煙臺 264003)

目的： 觀察載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成過程中血管平滑肌細胞瞬時受體電位通道5(TRPC5)蛋白的表達變化，以及阿托伐他汀藥物干預對TRPC5的影響并探討其作用機制。方法: 將40只6周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機分為模型組和他汀干預組，高脂飼料喂養(yǎng)建立動脈粥樣硬化模型。他汀干預組給予阿托伐他汀(20 mg·kg-1·d-1)灌胃，模型組給予等量生理鹽水灌胃。20只同齡雄性野生型C57BL/6J小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)作為正常對照組。各組小鼠分別喂養(yǎng)至20和30周齡，分別取10只取血并處死。取主動脈根部做石蠟切片行HE染色形態(tài)學觀察，測量并計算斑塊相對面積；免疫組織化學染色檢測各組小鼠TRPC5蛋白表達變化。取胸腹段主動脈行實時熒光定量PCR，檢測主動脈中TRPC5通道蛋白mRNA的表達水平。結果: 與模型組相比，阿托伐他汀干預組的血脂明顯下降，斑塊總面積明顯減小，TRPC5蛋白水平及 mRNA含量明顯下降；30周齡模型組的TRPC5蛋白表達稍高于20周齡模型組，但差異無統(tǒng)計學意義；30周干預組較20周干預組相比，TRPC5水平有降低趨勢且差異有統(tǒng)計學意義。結論: 阿托伐他汀可能通過下調TRPC5蛋白表達從而延緩動脈粥樣硬化進程。

TRPC5； 載脂蛋白E； 動脈粥樣硬化； 血管平滑肌細胞； 阿托伐他汀

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病最常見的基本病因，嚴重影響人類的生活質量和健康水平[1]。其病理生理過程是由多種危險因子導致血管內皮損傷，刺激多種細胞(包括淋巴細胞、巨噬細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞等)參與局部脂質和糖類積聚、纖維組織增生和鈣質沉著形成斑塊，并伴有動脈血管中層退變。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖與凋亡是決定動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[2-3]。其中，瞬時受體電位通道(transient receptor potential channel，TRPC)介導血管平滑肌細胞、血管內皮細胞、巨噬細胞等多種細胞參與了AS的病理生理過程[4]，且已有研究發(fā)現(xiàn)TRPC家族成員之一的TRPC5蛋白表達主要位于血管平滑肌細胞，參與其收縮、肥大、增殖和遷移等生理及病理過程[5]，能夠促進AS的發(fā)展。本實驗擬通過載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-knockout,ApoE-/-)小鼠建立AS模型，觀察AS病程中不同時點主動脈VSMCs內TRPC5蛋白表達的改變，以及阿托伐他汀干預治療后對該蛋白表達的影響，探討阿托伐他汀抗AS的作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物與試劑

實驗組選取6周齡ApoE-/-雄性小鼠(品系C57BL/6J)40只，正常對照組為同周齡C57BL/6J雄性小鼠20只，均購自北京大學醫(yī)學部實驗動物中心，合格證編號為SCXK(京)2011-0012。小鼠體重18～20 g，飼養(yǎng)條件為二級，室溫控制在23～25 ℃，相對濕度50%～60%，光照時間07:00～19:00，自由飲水及進食。阿托伐他汀由美國輝瑞公司惠贈(藥物批號：國藥準字J20070060)，用0.9%氯化鈉溶解。TRPC5抗體購自Abcam；SP試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；Trizol、反轉錄試劑盒和SYBR?Green熒光試劑盒為TaKaRa產品；其它相關試劑均由濱州醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心提供。

2 方法

2.1 動物分組與模型制備 選取40只6周齡ApoE-/-雄性小鼠給予高脂飲食(基礎飼料78.85%+脂肪21%+膽固醇0.15%)，隨機分為模型組(生理鹽水，0.1～0.2 mL，ig)和阿托伐他汀干預組(阿托伐他汀 20 mg·kg-1·d-1，ig)，每組20只。同時選取20只同齡C57BL/6J雄性小鼠作為正常對照組，給予普通飼料飲食。

2.2 標本處理 每組小鼠喂養(yǎng)至20周齡和30周齡時各取10只處死，處死前禁食不禁水12 h。無菌條件下取出心臟和主動脈根部，4%多聚甲醛固定處理后石蠟包埋，制成4 μm連續(xù)切片用于HE染色以及TRPC5的免疫組織化學染色。分離出主動脈胸腹段于-80 ℃凍存，抽提主動脈總RNA，反轉錄后采用SYBR?Green實時熒光定量PCR檢測TRPC5 mRNA的表達。

2.3 血清學指標測定 全血以2 500 r/min 4 ℃低溫離心20 min，取血清，應用全自動生化分析儀檢測甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)含量。

2.4 病理組織學圖像測量和分析 主動脈根部石蠟切片行HE染色，用Image-Pro Plus 6.0形態(tài)計量學測算斑塊面積及血管內外膜長度，回歸標準圓形后計算斑塊面積與血管管腔面積相對比值。免疫組化染色檢測TRPC5陽性染色積分吸光度值(integral absorbance，IA)(DAB顯色為棕褐色)。PBS緩沖液代替Ⅰ抗作為空白對照。結果判定：光鏡下，陽性表達的細胞圍繞藍色細胞核的胞漿呈棕褐色。每個標本共取5張切片染色，同一切片在相同環(huán)境下測量3次，取平均值作為測量結果。

2.5 RNA的提取和逆轉錄反應 采用Trizol兩步法抽提主動脈的總RNA，按照TaKaRa的反轉錄試劑盒要求反轉錄提取總RNA，10 μL反應體系如下：RNA 2 μL，5×PrimeScript buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Prime(50 μmol/L) 0.5 μL，Random 6 mers(100 μmol/L) 0.5 μL，去RNA酶水 4.5 μL。反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，1個循環(huán)后最后得到的cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 Real-time PCR檢測主動脈血管中TRPC5 mRNA的表達 采用實時熒光定量PCR檢測TRPC5 mRNA的表達，內參照基因為GAPDH，由大連寶生物設計引物序列。TRPC5的上游引物為5’-ACAAAAAGGTCAACTACTCACCG-3’，下游引物為5’-CAGTGGCATAGTCCCCCTTCT-3’；GAPDH的上游引物為5’-AACTGCTTAGCACCCCTGGC-3’，下游引物為5’-ATGACCTTGCCCACACAGCCTT-3’。PCR反應體系如下：SYBR?Prime Ex Taq(Tli RNaseH Plus)10 μL，PCR上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，PCR下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，DNA模板 2 μL，dH2O 6.8 μL。反應條件為95 ℃ 30 s；然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s 共40個循環(huán)。反應結束，設定最佳閾值，得到Ct值。用2-ΔΔCt法計算。實驗重復3次。

3 統(tǒng)計學處理

計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 不同周齡各組小鼠血脂水平

ApoE-/-小鼠血脂可自發(fā)性升高，高脂飲食能加速血脂增高速度。與對照組比較，模型組血清的TC、TG和LDL-C均升高(P<0.05)，以TC和LDL-C增高最為明顯，且隨周齡增加而增高；而HDL-C有所下降(P<0.05)。給予阿托伐他汀后血清TC、TG和LDL-C均降低(P<0.05)，且以TC和LDL-C下降最為顯著，HDL-C水平有所升高(P<0.05)。30周齡干預組與20周齡干預組比較，TC和LDL-C有下降趨勢，HDL-C有升高趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 各組小鼠血脂水平的比較

*P<0.05vscontrol at the same age;#P<0.05vsmodel at the same age;△P<0.05vs20 weeks in the same group.

2 不同周齡小鼠主動脈粥樣硬化斑塊的病理學觀察

C57BL/6J小鼠正常組可見主動脈壁厚薄均勻，內膜完整，無動脈粥樣硬化斑塊形成，血管中層VSMCs亦未見明顯病理變化。20周齡ApoE-/-小鼠模型組主動脈內膜明顯增厚，局部可見明顯腔內凸起的纖維斑塊，纖維帽較完整，內含脂質中心及泡沫細胞，平滑肌細胞、彈力纖維及膠原組織構成纖維帽主要結構；干預組內膜不完整，無連續(xù)性，局部內膜明顯增厚，并有泡沫細胞聚集。30周齡模型組AS斑塊彌漫血管全管腔，纖維肌性成分減少，有壞死中心形成，斑塊底部有柳葉狀的膽固醇結晶；干預組斑塊面積及病變程度較模型組顯著減輕，見圖1。

Figure 1.Observation of aortas in each group under optical microscope(HE staining,×40).

3 不同周齡小鼠主動脈粥樣硬化斑塊面積定量分析

20周齡模型組、阿托伐他汀干預組與正常對照組 AS 斑塊面積/動脈總面積分別為0.20±0.03、0.14±0.01與0；30周齡模型組、阿托伐他汀干預組與正常對照組 AS 斑塊面積/動脈總面積分別為0.44±0.03、0.23±0.02與0；與20周齡模型組比較，30周齡模型組斑塊面積顯著增大(P<0.05)；而同一周齡小鼠斑塊面積相比較，阿托伐他汀干預組顯著小于模型組(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The plaque area/lumen area in different groups. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs model at the same age; #P<0.05 vs 20 weeks in the same group.

4 不同周齡小鼠主動脈TRPC5蛋白免疫組化IA值的表達變化

與正常組C57BL/6J小鼠比較，TRPC5蛋白在ApoE-/-小鼠模型組及阿托伐他汀干預組動脈粥樣硬化斑塊中的表達明顯增高(P<0.01)，且以模型組增高最為明顯；同周齡ApoE-/-小鼠阿托伐他汀干預組中TRPC5蛋白表達較模型組有所下降(P<0.01)。30周齡干預組與20周齡干預組相比較呈下降趨勢(P<0.05)。30 周齡ApoE-/-小鼠模型組與20周齡模型組相比，30周齡C57小鼠與20周齡C57BL/6J小鼠比較均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3～4。

5 不同周齡小鼠主動脈TRPC5 mRNA的表達變化

各時點ApoE-/-小鼠模型組的TRPC5 mRNA水平顯著高于正常組C57BL/6J小鼠(P<0.05)，給藥治療后明顯降低(P<0.05)。20周齡正常對照組C57BL/6J小鼠mRNA表達比30周齡正常組略高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。30周齡時ApoE-/-小鼠模型組TRPC5 mRNA表達稍高于20周齡模型組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；30周干預組較20周干預組相比有降低的趨勢，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

討 論

ApoE-/-小鼠[6]是目前公認的研究AS發(fā)病機制以及抗AS藥理學研究等方面最經典的動物模型之一，而C57/BL6J小鼠與其具有相同的遺傳背景，因而常在研究中作為健康對照組。ApoE-/-小鼠AS的發(fā)病機制是通過影響肝臟對VLDL和乳糜微粒代謝，使膽固醇殘粒在血漿堆積引起高脂血癥，血脂持續(xù)增高，大量膽固醇在血管壁沉積形成AS，這與人類動脈粥樣硬化形成過程相似[7]。ApoE-/-小鼠可以自發(fā)形成AS，高脂飲食能加速疾病進程。本實驗采用高脂飼喂ApoE-/-小鼠建立AS疾病模型，經觀察發(fā)現(xiàn)隨時間延長其血脂持續(xù)性增高，20周齡時形成表面的纖維帽，內含脂質、巨噬細胞、VSMCs和泡沫細胞的纖維斑塊，此時病變僅局限于部分血管壁；至30周齡演變?yōu)橹鄻影邏K，且斑塊彌漫整個血管橫切面，研究結果與劉劍剛等[8]的研究相一致。

動脈粥樣硬化始動環(huán)節(jié)為血管內皮受損， LDL在內皮下積聚并被自由基氧化，生成氧化修飾的低密度脂蛋白(oxidized LDL, ox-LDL)，ox-LDL參與VSMCs增殖與遷移，并促進和加速AS進展[9]。目前已證實VSMCs的增殖和遷移是決定AS及動脈損傷后再狹窄的關鍵因素[10]。AS發(fā)生發(fā)展過程中，作為對血管損傷和炎癥反應的一部分，VSMCs由收縮表型轉變?yōu)樵鲋潮硇?，不斷增殖、遷移到內膜，釋放大量細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，并參與纖維斑塊的構成。隨著AS病變發(fā)展，粥樣斑塊形成并向復合病變進展時，VSMCs發(fā)生凋亡并且遠大于增殖效應，引起斑塊易損甚至破裂。

Figure 3.The expression of TRPC5 in the VSMCs of different groups (IHC,×400). The arrows indicate the lumen of the blood vessels.

Figure 4.IA value of TRPC5 in the VSMCs of different groups. Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs control at the same age; ##P<0.01 vs model at the same age; △P<0.05 vs 20 weeks in the same group.

經研究發(fā)現(xiàn)TRPC家族在VSMCs中大量表達，最普遍的是TRPC1、TRPC4和TRPC5[11]。其中TRPC5通道蛋白具有脂質離子亞型受體特性，可識別作為ox-LDL主要成分的溶血磷脂膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)，并且被ox-LDL中的1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)成分激活[12]。本實驗觀察發(fā)現(xiàn)：TRPC5通道蛋白在正常組C57BL/6J小鼠主動脈VSMCs中是穩(wěn)定低表達的；20周齡ApoE-/-小鼠主動脈VSMCs中表達量明顯增高，至30周齡時TRPC5蛋白表達量增加不明顯。其機制可能是，高脂血癥引起血管管壁ox-LDL明顯增高，激活了TRPC5通道，促進VSMCs內Ca2+的增加，并刺激VSMCs由收縮表型轉變?yōu)樵鲋潮硇瓦w移至血管內膜，吞噬ox-LDL及脂質形成泡沫細胞，參與纖維斑塊形成并促進AS進展。隨病情進展至粥樣斑塊時，由于細胞外基質、各種蛋白酶、多種刺激因子及胞內Ca2+超負荷等相互作用，引起細胞損傷和促進VSMCs凋亡程序啟動，影響了TRPC5蛋白的表達。

Figure 5.The mRNA expression of TRPC5 in different groups. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs control at the same age; #P<0.05 vs model at the same age; △P<0.05 vs 20 weeks in the same group.

阿托伐他汀屬于3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，許多研究發(fā)現(xiàn)他汀類除調脂作用外，還具有改善血管內皮細胞功能、抗炎、抗氧化、抑制VSMCs增生等其它作用[13]，并進一步發(fā)現(xiàn)他汀可以對多種離子通道進行調控[14]。各種證據亦證明他汀類可以穩(wěn)定AS斑塊[15]，對心腦血管發(fā)揮保護作用。2013年美國心臟病學會與美國心臟協(xié)會聯(lián)合頒布的最新版降膽固醇治療降低動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)風險指南[16]中亦強調了他汀類藥物在ASCVD一二級預防的重要作用，但目前關于他汀抗AS的具體機制仍不明確。該實驗發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀除了在高脂飼喂的ApoE-/-小鼠中的直接降脂作用外，還可以顯著縮小ApoE-/-小鼠主動脈 AS斑塊面積并下調TRPC5蛋白的表達，且隨治療時間延長其抑制作用更明顯?？赡軝C制為，阿托伐他汀一方面通過加速血液中LDL清除，減少其被氧化為ox-LDL的機會，并減少TRPC5通道的激活從而抑制VSMCs增殖和遷移；另一方面可以通過降低細胞內活性氧，減少氧化應激從而抑制了TRPC5蛋白表達；抑制細胞內鈣超載，延緩了動脈粥樣硬化的病理進程。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)TRPC5在ApoE-/-小鼠AS斑塊形成的過程中表達上調，而阿托伐他汀可以下調TRPC5通道表達，且下調作用隨時間延長更為顯著。因此推測阿托伐他汀可能通過減少TRPC5表達來抑制VSMCs增殖和遷移，從而延緩AS斑塊進展。我們將通過后續(xù)實驗進一步探討TRPC5在VSMCs增殖與遷移過程中的具體分子機制及阿托伐他汀的作用機制，為AS防治提供新的思路。

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Effect of atorvastatin on TRPC5 expression in atherosclerosis of apolipoprotein E-knockout mice

QI Jie1, XU Fang2, MA Hui1, CUI Jian-guo1, ZHANG Qing-tan1

(1DepartmentofGeriatricMedicine,AffiliatedHospitalofBinzhouMedicalUniversity,Binzhou256603,China;2DepartmentofPathophysiology,BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,China.E-mail:qtzhangby@126.com)

AIM: To observe the changes of transient receptor potential channel 5 (TRPC5) in vascular smooth muscle cells (VSMCs) of apolipoprotein E-knockout (ApoE-/-) mice and the effect of atorvastatin interference, and to investigate the mechanism of atorvastatin therapy. METHODS: MaleApoE-/-mice at 6 weeks of age were used to establish the atherosclerosis model by feeding with hyperlipidic diet. The mice were randomly divided into model group and atorvastatin group. The mice in atorvastatin group were lavaged with atorvastatin at 20 mg·kg-1·d-1, while the mice in model group received normal saline. The healthy C57BL/6J mice with the same age and the same genetic background, feeding with ordinary food, served as control group. At the time points of 14 and 24 weeks, the mice were sacrificed. The serum was collected for detecting the lipid levels. The aortic roots of the heart were taken to make paraffin sections with HE staining for measuring and comparing the relative atherosclerotic plaque area in each section. The expression of TRPC5 in VSMCs was examined with immunohistochemical staining. The mRNA levels of TRPC5 in the serum and the thoracoabdominal aorta were measured by real-time PCR. RESULTS: Compared with model group, blood lipids in atorvastatin group were significantly decreased, and the formation of plaque under aorta intima also decreased. The protein expression of TRPC5 in atorvastatin group decreased significantly compared with model group. Compared with 20-week model group, TRPC5 in 30-week model group showed increasing tendency, but has no statistical significance. Compared with 20-week atorvastatin group, TRPC5 of 30-week atorvastatin group declined. CONCLUSION: Atorvastatin suppresses TRPC5 expression, thus attenuating atherosclerotic development inApoE-/-mice.

TRPC5; Apolipoprotein E; Atherosclerosis; Vascular smooth muscle cells; Atorvastatin

1000- 4718(2015)03- 0457- 06

2014- 11- 10

2014- 12- 08

國家自然科學基金資助項目(No. 81401625)； 濱州醫(yī)學院科研啟動基金資助項目(No. BY2009KYQD05)

△通訊作者 Tel: 0543-3258527； E-mail: qtzhangby@126.com

R541.4； R972+.6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.013