韋 睿， 李 中， 蔡秀娟， 何 露， 雷清鋒

(1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院神經(jīng)科，廣東 廣州 510655； 2中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東 廣州 510530)

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阿爾茨海默病患者尿液細(xì)胞向誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化*

韋 睿1,2， 李 中1△， 蔡秀娟2， 何 露1， 雷清鋒1

(1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院神經(jīng)科，廣東 廣州 510655；2中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東 廣州 510530)

目的： 獲得阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。方法: 選取3例臨床診斷明確的AD病例，收集病人尿液，分離出尿路上皮細(xì)胞，對(duì)所得細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。利用電轉(zhuǎn)染的方法將帶有Oct4、Sox2、Klf4和SV40LT的質(zhì)粒導(dǎo)入原代細(xì)胞內(nèi)，將其重編程為iPS細(xì)胞。隨后利用雙向抑制Smad通路的方式繼續(xù)誘導(dǎo)其神經(jīng)分化。結(jié)果: AD病人尿液來(lái)源的細(xì)胞(以下稱為尿液細(xì)胞)均成功誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，其誘導(dǎo)效率與正常人來(lái)源的細(xì)胞無(wú)明顯差異。且病人的iPS細(xì)胞可成功分化為神經(jīng)細(xì)胞，分化效率亦與正常人來(lái)源細(xì)胞相近。結(jié)論: 阿爾茨海默癥患者來(lái)源的尿液細(xì)胞可重編程為iPS細(xì)胞，所得到的iPS細(xì)胞可成功分化成有功能的神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

阿爾茨海默病； 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞； 神經(jīng)分化

隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的發(fā)病率逐年增高，但迄今為止AD的病因與致病機(jī)制仍不明，治療方面也無(wú)重大突破。散發(fā)性AD(sporadic AD，sAD)，占AD發(fā)病人數(shù)的90%以上，雖有一定的家族聚集傾向，但其發(fā)病無(wú)法歸咎于某個(gè)特定基因的異常。截至2009年，人們通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)共發(fā)現(xiàn)20多個(gè)sAD相關(guān)基因[1]，但這些基因如何致病仍然不清楚。目前sAD的發(fā)病被歸結(jié)于遺傳與環(huán)境等多因素作用的結(jié)果。

2006年底，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)技術(shù)由日本學(xué)者Takahashi等[2]首次在Cell雜志上發(fā)表，在生物及醫(yī)學(xué)界引起了巨大轟動(dòng)。由于iPSCs能夠攜帶某些疾病患者特異性基因，并且有向各種組織分化的潛能，因此很快被廣泛用于建造包括AD在內(nèi)的多種疾病模型[3-6]。2012年，Israel等[7]同時(shí)用2例淀粉樣蛋白前體基因突變的家族性AD(familial AD, FAD)患者及2例sAD患者來(lái)源的iPS細(xì)胞分化成為神經(jīng)細(xì)胞，F(xiàn)AD檢測(cè)出了與其基因突變相一致的病理表型，包括Aβ、p-tau的高表達(dá)等。有意思的是，2例sAD患者中有1例也出現(xiàn)了與FAD一致的表型，而這例病人并沒(méi)有任何FAD相關(guān)的基因異常。2013年，Kondo等[8]也在1例sAD患者iPSCs分化來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了AD相關(guān)病理表型——Aβ寡聚體升高。這些發(fā)現(xiàn)提示在sAD患者的基因組中，或許還存在著某些未知的致病因素導(dǎo)致了與FAD類似的病理過(guò)程，有待我們進(jìn)行進(jìn)一步的探究。因此，我們選擇了臨床上所見(jiàn)的3例典型的sAD患者，取得他們的尿液細(xì)胞誘導(dǎo)成IPS細(xì)胞，并初步探究這些iPS細(xì)胞向神經(jīng)方向分化的能力。為今后sAD的機(jī)制研究，甚至臨床早期診斷以及藥物篩查打下基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 一般資料

選取了3例典型散發(fā)性阿爾茨海默病患者，分別來(lái)自中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院和佛山市第一人民醫(yī)院，入組的AD患者均符合目前臨床上廣泛運(yùn)用的美國(guó)國(guó)家衰老研究所和阿爾茨海默病學(xué)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在早期、顯著的情景記憶損害，簡(jiǎn)短精神狀態(tài)檢查(min-mental state examination,MMSE)得分低于24分；(2)MRI分析顯示海馬、內(nèi)嗅區(qū)、杏仁核等結(jié)構(gòu)的萎縮;(3) 排除額顳葉癡呆、路易體癡呆以及血管性癡呆等非AD性癡呆。經(jīng)患者或家屬同意并簽字，見(jiàn)表1。

表1 患者信息

2 細(xì)胞、質(zhì)粒和主要試劑

2.1 細(xì)胞和質(zhì)粒 人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)H1、正常人iPS細(xì)胞UC05及質(zhì)粒PCEP4-E02ST2K、PCEP4-miR-302 cluster均由中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院潘光錦研究組惠贈(zèng)。

2.2 培養(yǎng)基及配方 尿細(xì)胞原代培養(yǎng)基為REGM Bullet Kit，購(gòu)自Lonza；hESCs及iPSCs培養(yǎng)基為mTeSR1，購(gòu)自Stem Cell；N2B27培養(yǎng)基為 (1% N-2 supplement+99% DMEM/F12)+(2% B-27 supplement+98% Neurobasal)；KSR培養(yǎng)基:10% 血清替代物(Knockout serum replacement, KSR)+39% DMEM/F12+0.5% L-GlutaMax+0.5% NEAA+0.1% β-巰基乙醇;N-2 supplement、B-27 supplement、Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自Life Technologies；DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、KSR、L-GlutaMax、NEAA、β-巰基乙醇購(gòu)自Gibco。

2.3 其它主要試劑 DFBS、0.25% 胰酶-EDTA消化液、膠原酶IV購(gòu)自Gibco；Matrigel購(gòu)自BD；明膠(Gelatin)、Accutase細(xì)胞消化液、Smad通路抑制劑SB431542水合物和dorsomorpin、微管相關(guān)蛋白2(microtuble-associated protein 2, MAP2)、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、tubulin抗體購(gòu)自Sigma；Oct-4抗體、階段特異性胚胎抗原4(stage-specific embryonic antigen 4,SSEA4)抗體、TRA-1-60抗體、TRA-1-81抗體購(gòu)自Abcam；Pax6抗體、Sox1抗體、Sox2抗體購(gòu)自Millipore；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子購(gòu)自Invitrogen；Dispase消化酶購(gòu)自Life Technologies。

3 主要方法

3.1 尿液細(xì)胞的收集與培養(yǎng) 預(yù)先用1%的明膠鋪于6孔板中，1 mL每孔，置于培養(yǎng)箱中包被20 min以上。用無(wú)菌瓶收取200 mL左右尿液，400×g離心10 min，去上清，剩余約2～3 mL，加50 mL PBS洗1遍，400×g離心10 min，用2 mL REGM培養(yǎng)基重懸，接種于明膠包被好的6孔板中。將處理好的細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中，隔天半換液，約3～5 d可見(jiàn)細(xì)胞貼壁。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至每孔60%以上(7～14 d左右)時(shí)予以傳代。用0.25%的胰酶消化，接種于10 cm盤內(nèi)。隔1～2 d換液1次，約 1 周時(shí)間可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)滿10 cm盤。

3.2 利用非病毒方法進(jìn)行iPS細(xì)胞的重編程 將準(zhǔn)備好的10 cm盤細(xì)胞用0.25%胰酶消化，離心去上清；根據(jù)說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備好電轉(zhuǎn)溶液和質(zhì)粒(PCEP4-E02ST2K、PCEP4-miR-302 cluster)，按儀器(NucleofectorTM2b Device，Lonza)說(shuō)明進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，導(dǎo)入帶有Oct4、Sox2、Klf4和SV40LT的質(zhì)粒。電轉(zhuǎn)后第 1 天用REGM培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞密度，1 個(gè)10 cm盤細(xì)胞接種于6孔板2～3個(gè)孔。第2 天換成mTeSR1培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。隔天換液，注意觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

3.3 iPS細(xì)胞的培養(yǎng)及純化 約2周左右可見(jiàn)原代細(xì)胞出現(xiàn)較明顯形變，18 d左右可見(jiàn)iPS克隆形成。成熟的iPS克隆細(xì)胞之間聯(lián)系緊密，與原代細(xì)胞的分界較為清晰。此時(shí)可在顯微鏡下挑取iPS細(xì)胞克隆，重新接種于Matrigel包被的24孔板內(nèi)，待克隆長(zhǎng)大后再逐漸傳代到12孔板和6孔板中。擴(kuò)增過(guò)程中注意觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)混雜有其它非iPS細(xì)胞時(shí)要及時(shí)純化。純化方法主要有以下幾種：當(dāng)分化細(xì)胞較少且位置局限時(shí)，可用細(xì)針于顯微鏡下刮除，或者直接用吸引器吸除；分化細(xì)胞較多且位置分散時(shí)，可用膠原酶Ⅳ消化30～60 min，iPS細(xì)胞由于貼壁較松，更容易被消化下來(lái)，以此達(dá)到純化目的。

3.4 定向誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向神經(jīng)方向分化 將無(wú)分化的iPS細(xì)胞接種于Matrigel包被的 6 孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基[N2B27培養(yǎng)基+SB431542(5 μ/L)+dorsomorpin(1 μmol/L)]。第8 天撤掉SB431542和dorsomorpin。約第16 天可見(jiàn)神經(jīng)花環(huán)結(jié)構(gòu)形成，挑取花環(huán)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)并進(jìn)行鑒定。

3.5 Real-time PCR鑒定各基因的表達(dá) Trizol裂解細(xì)胞，提取總RNA。使用SYBR Premix EX Taq試劑盒進(jìn)行real-time PCR，擴(kuò)增多能性基因Oct-4、Sox2、Nanog及神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)基因PAX6、Nestin、Sox1、Sox2、Vimentin。GAPDH作為內(nèi)參照。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Graphpad Prism 6.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。各基因在不同細(xì)胞中的表達(dá)差異采用單因素方差分析檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AD患者尿液來(lái)源的細(xì)胞均能成功誘導(dǎo)成為iPS細(xì)胞

按上述步驟收取患者尿液細(xì)胞后，約3 d可見(jiàn)細(xì)胞貼壁(圖1)。至第8 天細(xì)胞長(zhǎng)至每孔60%以上。傳代到10 cm盤內(nèi)繼續(xù)擴(kuò)增，約 12 d時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞布滿10 cm盤。對(duì)擴(kuò)增好的尿細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后10 d AD患者來(lái)源的原代細(xì)胞可見(jiàn)不同程度的形變，鏡下見(jiàn)原代細(xì)胞逐漸由梭型轉(zhuǎn)變成圓形，聚集成團(tuán)，細(xì)胞核比例增大。18 d左右可見(jiàn)成簇的iPS克隆形成，AP染色可初步判斷這些細(xì)胞存在干細(xì)胞特性(圖2)。這些克隆挑出后可進(jìn)行擴(kuò)增和穩(wěn)定傳代。對(duì)所得到的iPS細(xì)胞(圖3A)進(jìn)行real-time PCR鑒定(圖3B)，病人來(lái)源的iPS細(xì)胞均有內(nèi)源性干性基因Oct4、Sox2、Nanog的表達(dá)。我們以人胚胎干細(xì)胞H1作為陽(yáng)性對(duì)照，其中Oct4表達(dá)量較H1相近，Sox2表達(dá)量略低,而Nanog表達(dá)普遍比H1高。免疫熒光鑒定(圖3D)也發(fā)現(xiàn)Oct4、SSEA4、TRA1-60、TRA1-81的蛋白表達(dá)，Oct4、SSEA4的表達(dá)與H1相近，而TRA1-60、TRA1-81的表達(dá)量略低，在同樣參數(shù)下激發(fā)的熒光強(qiáng)度較弱。核型鑒定均未出現(xiàn)異常(圖3C)。結(jié)果表明所有AD病人尿液來(lái)源的原代細(xì)胞均成功重編程為iPS細(xì)胞，這些細(xì)胞形成存在類似于人胚胎干細(xì)胞的特性，但也有一定區(qū)別。

2 AD患者來(lái)源的iPS細(xì)胞均能夠向神經(jīng)方向分化，形成有功能的神經(jīng)元

為了觀察AD患者來(lái)源的iPS是否能夠正常進(jìn)行神經(jīng)分化，我們參照文獻(xiàn)，在N2B27培養(yǎng)體系加入2個(gè)Smad通路的抑制劑SB431542和dorsomorpin，定向誘導(dǎo)iPSCs向神經(jīng)方向分化[9-10]。第8 天時(shí)觀察細(xì)胞核質(zhì)比變小，已基本失去干細(xì)胞形態(tài)，誘導(dǎo)第14～16 天可見(jiàn)神經(jīng)花環(huán)形成，將花環(huán)挑出后懸浮培養(yǎng)，形成透亮的神經(jīng)球(圖4A)。取神經(jīng)球進(jìn)行real-time PCR鑒定(圖4C)，結(jié)果顯示這些神經(jīng)球已基本無(wú)胚胎干細(xì)胞特異的基因Oct4和Nanog表達(dá)，而表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)基因如Pax6、vinemtin、nestin等，且同一個(gè)基因不同細(xì)胞間的表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)。發(fā)現(xiàn)將神經(jīng)球消化貼壁后進(jìn)行免疫熒光鑒定，可見(jiàn)患者來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞均有表達(dá)Pax6、Sox1、Sox2等特異性蛋白(圖4B)。貼壁分化14d后進(jìn)行免疫熒光鑒定，可見(jiàn)MAP2、tubulin、GFAP等神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，說(shuō)明這些神經(jīng)具備分化成為神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力(圖4D)。繼續(xù)分化至30 d，膜片實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)到與正常神經(jīng)元類似的鈉鉀電流活動(dòng)以及動(dòng)作電位情況(圖4E、F)，表明分化形成的神經(jīng)元具有正常電生理活性。

Figure 1.The primary cultured urine-derived cells from the AD patients.

Figure 2.Generation of iPSC lines. The transformation of primary cells during reprogramming.

討 論

阿爾茨海默病是長(zhǎng)期以來(lái)困擾科學(xué)家們的一大難題。早期的AD研究主要局限于尸檢來(lái)源的大體模型、動(dòng)物模型以及一些非人類神經(jīng)元的細(xì)胞模型。然而大體模型只能展現(xiàn)疾病的終末狀態(tài)；鑒于種屬之間的巨大差異，動(dòng)物模型難以重復(fù)人類AD的病程。我們?cè)谝酝墓ぷ髦幸彩褂眠^(guò)轉(zhuǎn)入swAPP基因(一種FAD相關(guān)的突變基因)的HEK293細(xì)胞以及秀麗線蟲(chóng)作為AD的疾病模型[11-12]進(jìn)行相關(guān)的藥物研究。然而僅僅導(dǎo)入1個(gè)突變基因的細(xì)胞并不能很好地代表這個(gè)疾病，尤其是sAD，線蟲(chóng)模型亦是如此。因此，我們一直致力于尋找和建立更具代表性的疾病模型，以便更好地探究AD的發(fā)病機(jī)制和治療手段。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的出現(xiàn)為AD研究提供了新的思路，許多研究發(fā)現(xiàn)，由iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元細(xì)胞能夠特異性表達(dá)AD的相關(guān)病理表型[7-8, 13]。我們認(rèn)為構(gòu)建AD患者來(lái)源的iPS細(xì)胞并誘導(dǎo)其神經(jīng)分化將為AD研究提供很大幫助。

本實(shí)驗(yàn)中得到的典型sAD患者的iPS細(xì)胞，具備類似于胚胎干細(xì)胞的形態(tài)、類似的基因以及蛋白表達(dá)，且其誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)、各種干性基因的表達(dá)均未發(fā)現(xiàn)異常。雖然結(jié)果中iPSCs的干性基因表達(dá)與人胚胎干細(xì)胞存在差異，但這些差異并不顯著(在0.5～2倍之間)；且對(duì)照組正常人來(lái)源的iPS細(xì)胞UC05細(xì)胞的干性基因表達(dá)與人胚胎干細(xì)胞之間同樣存在細(xì)微差異，因此可以認(rèn)為這些差異來(lái)源于iPS細(xì)胞本身，與AD疾病無(wú)直接關(guān)系。綜上，此次所獲取的患者來(lái)源的細(xì)胞均可正常進(jìn)行重編程。

所有患者的原代細(xì)胞直接從尿液中分離[14]，不同于以往常用的取皮膚或者身體其它部分的組織進(jìn)行原代細(xì)胞分離和培養(yǎng)，尿液來(lái)源不僅充足方便，而且把對(duì)患者的傷害降到了最小，更加利于臨床應(yīng)用。同時(shí)也驗(yàn)證了AD患者尿液中來(lái)源的細(xì)胞可以正常重編程為iPS細(xì)胞。在誘導(dǎo)方法上，經(jīng)典的iPS重編程使用逆轉(zhuǎn)錄病毒方法，然而逆轉(zhuǎn)錄病毒可隨機(jī)整合到宿主染色體中，干擾宿主其它基因的功能，甚至激活癌基因，有致癌的危險(xiǎn)。本次實(shí)驗(yàn)中iPS細(xì)胞的重編程采用電轉(zhuǎn)化方法，避開(kāi)了病毒的隨機(jī)插入問(wèn)題，得到的iPS細(xì)胞相對(duì)更為安全，為今后進(jìn)一步的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

為了觀察這幾例患者來(lái)源的iPS細(xì)胞是否能夠正常進(jìn)行神經(jīng)分化，我們參照文獻(xiàn)，利用成熟的單層貼壁誘導(dǎo)的方式，定向誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向神經(jīng)方向分化。結(jié)果表明所有患者的iPS細(xì)胞均能正常向神經(jīng)方向分化。對(duì)于這幾例iPS初步分化結(jié)果顯示，在iPS細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的階段其分化效率與正常人來(lái)源的無(wú)異，且定向分化形成的神經(jīng)干細(xì)胞以及神經(jīng)元與UC05及hESCs來(lái)源的細(xì)胞在各項(xiàng)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，以及電生理活性方面沒(méi)有明顯區(qū)別。許多其它實(shí)驗(yàn)也得到過(guò)類似的結(jié)果[7, 15-16]。這表明AD雖然以神經(jīng)元的過(guò)度凋亡為重要表型之一[17]，但在神經(jīng)系統(tǒng)形成的早期階段對(duì)神經(jīng)發(fā)育并無(wú)影響。另外，也可能由于樣本量的不足和檢測(cè)手段的局限，未能發(fā)現(xiàn)其中更為細(xì)微的差別。

Figure 3.The identification of iPSCs. A: the characteristics of iPSC clones； B: mRNA expression of Oct4, Sox2 and Nanog relative to H1 cells； C: karyotype identification； D: immunofluorescence identification. AMD01～03: AD patients 01～03; C1～C4: clones 1～4; P6～P9: passages 6～9; P40: passage 40. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs H1.

Figure 4.Neural conversion of human iPS cells. A: the transformation of iPSCs during neural differentiation； B: immunofluorescence shows most of these were Pax6, Sox1, Sox2 positive cells； C: the expression of neural related genes (Sox1, Sox2, Pax6, nestin, vinemtin) were detected by real-time PCR (Mean±SD.n=3); D: after 2 weeks of spontaneous differentiation, the tubulin (+) /MAP2 (+) neurons and GFAP (+) neural glial cells were observed； E: current-clamp recording showing voltage-gated ion channels from a neuron differentiated from patients-derived iPSCs； F: a representative train action potentials in a neuron.

sAD的發(fā)病機(jī)制眾說(shuō)紛紜。近幾年利用iPS技術(shù)進(jìn)行AD的研究中發(fā)現(xiàn)，sAD患者iPSCs分化來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)出多種不同表型，包括細(xì)胞外Aβ40、p-tau的升高[7]，細(xì)胞內(nèi)Aβ寡聚體的升高[8]，或是不表現(xiàn)病理特征，與正常對(duì)照一致。這便提示我們?cè)谌缃竦膕AD的人群中，可能存在不同的分型。本實(shí)驗(yàn)只是初步鑒定了所獲得的AD患者來(lái)源細(xì)胞的iPSCs重編程以及神經(jīng)分化能力，對(duì)于AD相關(guān)的其它表型還有待進(jìn)一步探究。接下來(lái)我們希望繼續(xù)尋找更多典型AD病例，擴(kuò)大樣本量，建立sAD患者特異性的iPS細(xì)胞庫(kù)，從而為今后深入研究AD的致病機(jī)制甚至找到sAD不同亞型、開(kāi)發(fā)新型安全治療藥物以及尋找更優(yōu)化的治療方案提供便利。與此同時(shí)，干細(xì)胞治療是神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的一個(gè)新治療方向。iPS細(xì)胞由于其免疫排斥低及來(lái)源廣泛的巨大優(yōu)勢(shì)，為干細(xì)胞治療廣泛應(yīng)用于臨床帶來(lái)了希望[18]。這些AD患者經(jīng)iPSCs來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)初步檢測(cè)，可以確定其具有正常神經(jīng)元的生理功能。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)后，那些不帶有AD相關(guān)表型的神經(jīng)細(xì)胞則可能成為今后干細(xì)胞治療的一大細(xì)胞來(lái)源。

致謝: 本工作得到中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供的重編程所需質(zhì)粒PCEP4-E02ST2K、PCEP4-miR-302 cluster；廣州生物醫(yī)藥與健康研究院的潘光錦老師、蔡秀娟老師，以及蘇整會(huì)、李迪、馬寧、單永禮等同學(xué)在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和分子生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面給予了寶貴的指導(dǎo)和幫助，在此一并致以由衷的感謝！

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Generation of induced pluripotent stem cells and neural cells from urine-derived cells of Alzheimer disease patients

WEI Rui1, LI Zhong1, CAI Xiu-juan2, HE Lu1, LEI Qing-feng1

(1DepartmentofNeurology,TheSixthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China;2GuangzhouInstitutesofBiomedicineandHealth,ChineseAcademyofSciences,Guangzhou510530,China.E-mail:zslyjohn@163.com)

AIM: In this study, we aim to obtain the induced pluripotent stem cells (iPSCs) from the patients with sporadic Alzheimer disease (AD). METHODS: Three typical Alzheimer’s patients were chosen, and the epithelial cells were isolated from their urine. We reprogrammed these cells into induced pluripotent stem cells by transfection of 4 factors (Oct4， Sox2, Klf4 and SV40LT) with the technique of electro-transfection. After getting these iPSCs, we continue to differentiate them into neural cells by a specific method—dual inhibition of Smad signaling. RESULTS: The primary cells from 3 AD patients were successfully reprogrammed to iPSCs, and these patients-derived iPSCs were differentiated into neural cells. There was no significant difference, during iPSCs reprogramming and neural differentiation, between cells from AD patients and normal people. CONCLUSION: The urine cells from AD patients were able to transfer to iPSCs, functional neurons and neurogliocytes.

Alzheimer disease; Induced pluripotent stem cells; Neural differentiation

1000- 4718(2015)03- 0421- 07

2014- 09- 05

2014- 10- 28

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(No. A2012211);天河區(qū)2014年度科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.201404kw028)

△通訊作者 Tel: 020-38274637； E-mail: zslyjohn@163.com

R749.1+6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.007