陽(yáng) 康，廖 凱，薩仁高娃，黃 兵，江 洪

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

·論 著·

短期頸動(dòng)脈壓力感受器電刺激對(duì)犬心肌缺血再灌注損傷的影響

陽(yáng) 康，廖 凱，薩仁高娃，黃 兵，江 洪

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

目的 評(píng)價(jià)短期頸動(dòng)脈壓力感受器電刺激(Carotid baroreceptors stimulation，CBS)對(duì)犬心肌缺血再灌注損傷的影響。方法36只成年雜種犬隨機(jī)分為三組(n=12)：假手術(shù)組(Sham組)，缺血再灌注組(I/R組)和頸動(dòng)脈壓力感受器刺激組(CBS組)。I/R組和CBS組分別結(jié)扎左冠脈前降支1 h和再灌注6 h完成心肌缺血再灌注損傷模型，Sham組只穿線不結(jié)扎冠脈。CBS組在心肌缺血前2 h對(duì)右側(cè)頸動(dòng)脈竇開(kāi)始進(jìn)行高頻電刺激，一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，刺激參數(shù)：頻率50 Hz，脈寬0.5 ms，刺激強(qiáng)度隨血壓進(jìn)行調(diào)整，以保持血壓較刺激前下降10%。于缺血前(基礎(chǔ)狀態(tài))、缺血15 min、30 min、60 min和再灌注0.5 h、2 h、6 h時(shí)記錄心率(HR)和平均動(dòng)脈壓(MAP)。各組隨機(jī)抽取6只犬于于再灌注6 h后采用依文斯蘭-氯化三苯基氮唑(TTC)雙染色法檢測(cè)心肌缺血和心肌梗死面積。各組剩余6只犬于再灌注6 h分別經(jīng)頸內(nèi)靜脈采血，采用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-6。采血后，迅速取出缺血區(qū)心肌組織，檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性觀察中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況。結(jié)果與Sham組比較，I/R組和CBS組心肌梗死面積，MPO活性，血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量升高(P＜0.05)；與I/R組比較，CBS組心肌梗死面積，MPO活性，血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低(P＜0.05)。結(jié)論短期頸動(dòng)脈壓力感受器電刺激可減輕犬心肌缺血再灌注損傷，其機(jī)制與抑制中心粒細(xì)胞向缺血組織浸潤(rùn)以及抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

頸動(dòng)脈壓力感受器電刺激；心肌缺血再灌注損傷；炎癥反應(yīng)

在發(fā)達(dá)國(guó)家，心肌梗死是引起死亡的主要原因[1]。再灌注治療是應(yīng)對(duì)急性心肌梗死的最佳方法，但是挽救缺血心肌的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致再灌注損傷[2]。炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注(I/R)損傷的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著極為重要的作用。在心肌缺血時(shí)炎癥介質(zhì)對(duì)損傷組織的愈合必不可少，但是當(dāng)缺血部位再灌注后，過(guò)度的炎癥反應(yīng)反而會(huì)加重心肌損傷[3]?，F(xiàn)已證明，迷走神經(jīng)刺激能夠減小心肌I/R損傷，其機(jī)制與激活迷走神經(jīng)后通過(guò)膽堿能抗炎通路(CAP)抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)[4-5]。

動(dòng)脈壓力感受性反射(ABR)是心血管活動(dòng)最重要的調(diào)節(jié)機(jī)制。既往的研究表明長(zhǎng)期頸動(dòng)脈壓力感受器電刺激(CBS)治療頑固性性高血壓安全可行[6-9]。在犬心衰模型中，長(zhǎng)期CBS可改善心功能，逆轉(zhuǎn)心肌重塑，并與上調(diào)心臟β受體活性和NO合酶有關(guān)，提示長(zhǎng)期CBS可能具有抗炎的作用[10-11]。因此，我們提出一個(gè)假設(shè)，短期CBS可能在心肌缺血再灌注損傷時(shí)同樣具有保護(hù)心肌的作用，其機(jī)制可能與CBS抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型的建立 健康成年雜種犬36只，體重14～22 kg，均為雄性，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物中心提供。戊巴比妥鈉30 mg/kg前肢靜脈麻醉，以后每小時(shí)追加2 mg/kg維持麻醉狀態(tài)。氣管插管接動(dòng)物呼吸機(jī)，分離一側(cè)股、動(dòng)靜脈置入6F鞘管，動(dòng)脈通道連接壓力換能器監(jiān)測(cè)血壓，靜脈通道用于滴注生理鹽水補(bǔ)液。頸部脫毛備皮消毒后,在左側(cè)鎖骨上水平暴露左側(cè)頸內(nèi)靜脈備采血標(biāo)本?？照{(diào)室溫控制在25℃～30℃，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，犬下方放置電熱板以維持犬正常體溫。持續(xù)記錄體表心電圖(LEAD2000)。右頸動(dòng)脈竇位于右頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處的膨大組織。在右側(cè)下頜骨下方暴露左頸動(dòng)脈竇，用一小片封口膜隔離周圍組織。將一個(gè)特制的銀-氯化銀刺激電極圍繞頸動(dòng)脈竇植入，并連接到脈沖發(fā)生器(SEN-7103，日本光電，日本東京)。在3～5 min內(nèi)預(yù)先刺激3～4次確認(rèn)血壓和心率明顯下降，然后再妥善安置電極。頸動(dòng)脈竇的刺激參數(shù)為：頻率50 Hz，脈寬0.5 ms，刺激強(qiáng)度為引起血壓下降10%的電壓強(qiáng)度(3～7 V)[11]。然后經(jīng)左側(cè)第4肋間開(kāi)胸，剪開(kāi)心包，暴露心臟。于冠狀動(dòng)脈左前降支第對(duì)角支、第二對(duì)角支之間穿針引線(2-0#無(wú)創(chuàng)絲線)，連同一小段硬質(zhì)圓鈍頭的塑料管一起結(jié)扎，造成缺血，及時(shí)記錄心電圖的改變。結(jié)扎成功的標(biāo)準(zhǔn)：心肌缺血區(qū)局部發(fā)紺，同步Ⅱ?qū)?lián)ECG顯示ST段明顯抬高，缺血期間出現(xiàn)室性心律失常。結(jié)扎1 h后，在硬質(zhì)塑料管上切斷結(jié)扎線，恢復(fù)冠脈血流再灌注6 h。再灌注成功的標(biāo)準(zhǔn)：缺血區(qū)局部顏色變紅，同步Ⅱ?qū)?lián)ECG顯示ST段逐漸恢復(fù)到缺血前水平，并出現(xiàn)再灌注室性心律失常[12]。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 36只犬隨機(jī)分為3組(每組12只)：(1)Sham組：分離右頸動(dòng)脈竇，植入電極，不開(kāi)啟頸動(dòng)脈竇刺激儀；開(kāi)胸，分離左冠狀動(dòng)脈并穿線，但不結(jié)扎。(2)I/R組：分離右頸動(dòng)脈竇，植入電極，不開(kāi)啟頸動(dòng)脈竇刺激儀；結(jié)扎左冠脈前降支1 h，再灌注6 h。(3)CBS組：分離右頸動(dòng)脈竇，植入電極，結(jié)扎冠脈前先預(yù)刺激頸動(dòng)脈竇2 h，直至再灌注6 h；缺血1 h，再灌注6 h。

1.3 血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) 在實(shí)驗(yàn)全程中，采用LEDE2000多導(dǎo)電生理儀連續(xù)監(jiān)測(cè)犬的心率(HR)、動(dòng)脈收縮壓，舒張壓、平均動(dòng)脈壓(MAP)和Ⅱ?qū)?lián)心電圖。記錄心肌缺血前的HR和MAP，將該數(shù)值作為基礎(chǔ)值。然后記錄缺血15 min、30 min、60 min和再灌注0.5 h、2 h、6 h時(shí)的HR和MAP。

1.4 心肌梗死面積的測(cè)定 各組隨機(jī)抽取6只犬，于再灌注6 h后處死動(dòng)物，立即取下心臟，用生理鹽水沖洗干凈。采用依文斯蘭-TTC雙染色法測(cè)定心肌梗死面積。正常非缺血區(qū)染為藍(lán)色，梗死區(qū)(AN)呈灰白色，缺血非梗死區(qū)呈磚紅色，缺血心肌面積(AAR)為灰白色和磚紅色之和。對(duì)獲得的數(shù)碼相片采用Photoshop CS3 Extended軟件(Adobe公司，美國(guó))進(jìn)行測(cè)量處理，分別計(jì)算各部分的面積。缺血范圍用AAR與左室面積之比表示，梗死范圍以AN與AAR之比表示。

1.5 血清炎癥因子和心肌MPO活性的檢測(cè) 各組剩下的6只犬，于再灌注6 h經(jīng)頸內(nèi)靜脈采血，采用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度。具體操作步驟完全按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采血結(jié)束后處死動(dòng)物，迅速缺血區(qū)心肌組織，并用生理鹽水沖洗干凈。采用分光光度法測(cè)定髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性，試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有計(jì)量資料首先采用進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。應(yīng)用SPASS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組犬血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較 各組犬的HR、MAP比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 各組犬心肌梗死面積檢測(cè)結(jié)果比較 Sham組未觀察到心肌梗死，CBS組心肌梗死面積和缺血面積明顯低于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 各組犬再灌注6 h時(shí)血清炎癥因子濃度的檢測(cè)結(jié)果比較 I/R組和CBS組心肌再灌注6 h時(shí)血清TNF-α、IL-1β和IL-6均明顯高于Sham組，CBS組心肌再灌注6 h時(shí)血清TNF-α、IL-1α和IL-6濃度均明顯低于I/R組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表1 各組犬缺血期和再灌注期血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(±s)

表1 各組犬缺血期和再灌注期血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(±s)

注：1 mmHg=0.133 kPa。

130±10 129±8 130±7 103±10 101±10 98±10 HR (次/min) MAP (mmHg) Sham組I/R組CBS組Sham組I/R組CBS組133±15 130±12 126±10 100±6 101±7 96±9 126±8 125±10 123±5 102±9 103±5 98±12 132±10 127±8 128±12 101±12 105±12 97±10 134±7 128±13 120±13 98±5 99±10 99±8 128±12 127±15 125±9 97±12 98±8 101±2 135±6 126±7 128±12 102±7 104±3 97±15

表2 各組犬心肌梗死面積的檢測(cè)及比較結(jié)果(n=6，±s，%)

表2 各組犬心肌梗死面積的檢測(cè)及比較結(jié)果(n=6，±s，%)

注：與Sham組比較，aP＜0.05;與I/R組比較，bP＜0.05。

I/R組CBS組0±0 25.6±3.2a15.4±3.6ab0±0 32.4±5.1a20.5±3.2ab

注：與Sham組比較，aP＜0.05；與I/R組比較，bP＜0.05。

2.4 各組犬心肌缺血區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況比較 Sham組未進(jìn)行心肌缺血，因此未見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。I/R組可觀察到大量密集的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到心肌缺血區(qū)。CBS組心肌缺血區(qū)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度顯著下降。Sham組、I/R組、CBS組犬心肌缺血區(qū)MPO活性分別為(2.27±0.58)U/g，(20.14±3.27)U/g，(13.62±4.17)U/g。與Sham組比較，I/R組、CBS組MPO活性均顯著增高(P＜0.05)。CBS組的MPO活性顯著低于I/R組(P＜0.05)。

3 討論

既往研究證實(shí)長(zhǎng)期CBS能有效治療頑固性性高血壓和心力衰竭[6-11]，但還沒(méi)有研究報(bào)道短期CBS是否能夠減低心肌I/R損傷。本研究結(jié)果表明短期CBS能明顯減低心肌I/R損傷，表現(xiàn)為CBS降低心肌梗死面積。其次，短期CBS可以抑制心肌缺血區(qū)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，抑制全身炎癥因子的表達(dá)，從而減輕缺血再灌注引起的組織損傷。

缺血再灌注時(shí)過(guò)度的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致心肌I/R損傷主要的致病機(jī)制之一[13]。再灌注后形成的大量活性氧自由基(ROS)和補(bǔ)體激活可以直接觸發(fā)炎癥反應(yīng)，誘發(fā)心肌組織內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷[14-15]。在再灌注的早期階段，大量募集至缺血區(qū)心肌組織的中性粒細(xì)胞可釋放蛋白水解酶，氧化劑，表達(dá)炎癥細(xì)胞因子，粘附分子和趨化因子等致病物質(zhì)，最終導(dǎo)致心肌I/R損傷的形成[16]。既往研究也證實(shí)，通過(guò)抑制缺血區(qū)心肌組織內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集與浸潤(rùn)，降低MPO活性，能夠減輕I/ R損傷所引起心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌梗死面積和改善再灌注后心功能[17]。中性粒細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[18]，我們的研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注6 h后心肌缺血區(qū)可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，MPO活性顯著升高，說(shuō)明中性粒細(xì)胞在炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮了重要作用。

再灌注早期階段，可在犬心肌梗死區(qū)及周圍發(fā)現(xiàn)大量由炎癥細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子[19-20](TNF-α、IL-1β、IL-6等)，細(xì)胞粘附分子[21](ICAM-1等)和趨化因子[22](IL-8等)及其他炎癥介質(zhì)。TNF-α、IL-1α可以結(jié)合至細(xì)胞表面受體并觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活NF-кB進(jìn)一步誘導(dǎo)大量促炎因子的釋放，包括TNF-α、IL-1β、IL-6等，從而引發(fā)“炎癥瀑布”，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加重心肌損傷[23]。

頸動(dòng)脈壓力感受器是ARB的感受裝置。當(dāng)動(dòng)脈血壓升高時(shí)，通過(guò)頸動(dòng)脈壓力感受器和ARB傳入神經(jīng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)可感受刺激信號(hào)，隨后減少ABR傳出神經(jīng)神經(jīng)沖動(dòng)，導(dǎo)致血壓和交感神經(jīng)活性降低。電刺激頸動(dòng)脈壓力感受器可以明顯降低血壓正是基于這一機(jī)理。近年來(lái)，利用新一代頸動(dòng)脈壓力感受器刺激儀Rheos，展開(kāi)了一系列的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究。研究表明，慢性CBS可以明顯抑制血管、心臟、腎臟的交感神經(jīng)活性，同時(shí)提高迷走神經(jīng)活性，從而起到長(zhǎng)期降低血壓的作用[24]。Sabbah等[11]的研究提示CBS具有局部抗炎的作用并能改善心力衰竭衰犬的心功能。而本研究利用犬缺血再灌注模型證實(shí)了CBS能通過(guò)抑制急性炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，減輕心肌I/R損傷，從而發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。我們推測(cè)，CBS能夠調(diào)控炎癥反應(yīng)的機(jī)制可能是激活迷走神經(jīng)后通過(guò)膽堿能抗炎通路(CAP)抑制炎癥反應(yīng)[4-5]，或是通過(guò)激活下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸抗炎[25]，或是兩者之間的協(xié)同作用。這有待于我們進(jìn)一步研究明確。

本研究的不足之處在于我們并不清楚電刺激左側(cè)頸動(dòng)脈壓力感受器是否具有同樣的效果。由于我們觀察到電刺激右側(cè)頸動(dòng)脈竇對(duì)血壓和心率的影響更加明顯，且為了在一個(gè)給定的水平調(diào)整刺激強(qiáng)度，所以我們只選擇了電刺激右側(cè)頸動(dòng)脈壓力感受器。其次，我們并沒(méi)有設(shè)置將心率固定的對(duì)照組用以研究CBS的心肌保護(hù)。既往研究表明，降低心率能夠降低心肌氧耗量、增加心臟舒張灌注時(shí)間和增加側(cè)枝冠脈血流分布，從而減輕心肌I/R損傷[26-27]。本研究中CBS對(duì)心肌的保護(hù)作用是否含有心率降低的效應(yīng)?由于心率降低的幅度小于10%，因此我們推測(cè)心率減慢可能并不是主要機(jī)制。

綜上所述，CBS同迷走神經(jīng)刺激一樣，具有明顯調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的功能。與應(yīng)用藥物抑制單純某個(gè)炎癥介質(zhì)或細(xì)胞相比，CBS發(fā)揮機(jī)體生理功能的調(diào)節(jié)，具有快速、直接、局限、整合地調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的特點(diǎn)。我們的研究結(jié)果加深了對(duì)CBS調(diào)節(jié)心血管疾病發(fā)揮的潛在作用及其機(jī)制的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為治療缺血再灌注提供一個(gè)新策略，為臨床治療提供了試驗(yàn)依據(jù)和全新的研究思路。

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Effect of short-term carotid baroreceptors stimulation on myocardial ischemia reperfusion injury in dogs.

YANG Kang,LIAO Kai,SA Ren-gao-wa,HUANG Bing,JIANG Hong.
Department of Cardiology,People's Hospitial of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo evaluate the effect of short-term carotid baroreceptors stimulation(CBS)on myocardial ischemia reperfusion injury(IRI).MethodsThirty-six adult dogs were randomly divided into three groups (n=12):Sham group,ischemia reperfusion group(I/R group)and carotid baroreceptors stimulation group(CBS group). Dogs in I/R group and CBS group were given respectively 1 h left anterior descending coronary artery(LAD)ligation and 6 h reperfusion to complete IRI models,while dogs in Sham group received only threading.In CBS group,high frequency stimulations were performed on the right carotid sinus from 2 h before myocardial ischemia to the end of experiment(stimulation parameters:frequency 50 Hz,pulse width:0.5 ms,stimulation intensity adjusted according to blood pressure so as to keep the blood pressure down 10%before stimulation).Heart rate(HR)and mean arterial pressure(MAP)were recorded before ischemia,15 min,30 min and 60 min after ischemia,and 0.5 h,2 h and 6 h after reperfusion.Six dogs from each group were randomly selected to test the area of myocardial ischemia and myocardial infarction by Evans blue-triphenyl tetrazolium chloride(TTC)double-staining method at 6h after reperfusion.Internal jugular vein blood of the rest 6 dogs from each group were collected at 6 h after reperfusion,and serum TNF-α,IL-1β and IL-6 were tested by ELISA.After blood collection,we quickly took out the ischemic myocardial tissues to detect the infiltration of neutrophil cells through myeloperoxidase(MPO)activity observation.ResultsCompared with Sham group,the infarction area,MPO activity,serum levels of TNF-α,IL1-β and IL-6 of I/R group and CBS group were increased(P＜0.05);compared with IR group,all the above indexes of CBS group were lower(P＜0.05).ConclusionCarotid baroreceptors stimulation can reduce myocardial ischemia reperfusion injury.And the mechanism may be associated with the suppression of neutrophil infiltration and inflammatory reaction.

Carotidbaroreceptorsstimulation;Myocardialischemiareperfusioninjury;Inflammatoryreaction

R-332

A

1003—6350(2015)02—0157—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.02.0056

2014-10-07)

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81270339；81170195；81300812)、湖北省自然科學(xué)基金(編號(hào)：2013CFB302)、武漢市科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào)：2013060602010271)、武漢大學(xué)青年教師自主科研項(xiàng)目(編號(hào)：2042012121087)、武漢大學(xué)2012年博士研究生自主科研項(xiàng)目(編號(hào)：2012302020206)

江 洪。E-mail：jianghong58@gmail.com