楊 文，麥明曉，李海霞，王 英，周貞鑒，李文廣

（1.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571101；2.海南醫(yī)學(xué)院理學(xué)院，海南 ?？?571101；3.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571101）

·論 著·

二氫楊梅素-鎳配合物體內(nèi)外抗白假絲酵母菌作用研究

楊 文1，麥明曉2，李海霞3，王 英1，周貞鑒1，李文廣1

（1.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571101；2.海南醫(yī)學(xué)院理學(xué)院，海南 ?？?571101；3.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571101）

目的 觀察二氫楊梅素-鎳配合物(DMY-Ni)體外對(duì)白假絲酵母菌的抗菌活性，探討DMY-Ni治療小鼠白假絲酵母菌陰道炎的療效。方法采用試管二倍稀釋法測(cè)定DMY-Ni對(duì)臨床30例白假絲酵母菌(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門(mén)診患者陰道分泌物中分離)的最低抑菌濃度(MIC)值和最低殺菌濃度(MBC)值，同時(shí)模擬小鼠白假絲酵母菌陰道炎模型，分組給藥，SPSS17.0單因素方差分析法和配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果DMY-Ni對(duì)白假絲酵母菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，MIC為6.25～50μg/ml，MBC為12.5～200μg/ml，分別于模型組和給藥前比較，4種劑量組給藥7 d后小鼠陰道內(nèi)白假絲酵母菌落數(shù)均明顯下降（(P＜0.05或P＜0.01)，陰道局部病變?nèi)庋塾^察逐漸好轉(zhuǎn)，且高劑量組的治療效果最佳。結(jié)論4種劑量DMY-Ni對(duì)白假絲酵母菌陰道炎模型小鼠都有明顯治療效果，高劑量組的治療效果要優(yōu)于另外3種劑量組，為獲得臨床治療白假絲酵母菌陰道炎提供一個(gè)可參考的途徑。

二氫楊梅素-鎳配合物；白假絲酵母菌；抗菌活性

外陰陰道假絲酵母菌病(Vulvovaginitis candidiasis，VVC)是一種常見(jiàn)的由假絲酵母菌屬引起外陰陰道炎癥的婦科疾病。其主要以白假絲酵母菌(Candida albicans)感染居多，發(fā)病率高[1]。Magliani等[2]研究報(bào)道，大約75%的婦女一生中至少患過(guò)1次VVC，而再次發(fā)作的婦女占40%～50%，其中約有5%的婦女發(fā)展成復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病，嚴(yán)重影響著婦女的工作和生活質(zhì)量。目前，臨床對(duì)本病的治療仍以西醫(yī)抗真菌藥物直接殺滅病原菌為主，但仍存在首次治療的不徹底、抗真菌藥的濫用、診治不規(guī)范等問(wèn)題，使假絲酵母菌的耐藥性明顯增加，從而影響VVC的療效[3]。因此，提高對(duì)VVC的臨床診治和預(yù)防水平，對(duì)保護(hù)廣大婦女的身心健康有著不可忽視的臨床意義。

二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DMY)為具有抗氧化、清除自由基、抗菌、抗病毒、護(hù)肝、抗腫瘤等作用的黃酮類(lèi)化合物[4-6]。鎳是生命體必需的微量元素，主要作用是激活體內(nèi)的各種酶，控制核酸的代謝，維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)等，對(duì)機(jī)體的生理功能起重要作用[7-8]。黃酮類(lèi)與金屬元素形成配合物的生物活性通常與金屬中心離子的性質(zhì)有關(guān)，具有提高生物活性的作用，甚至產(chǎn)生新的獨(dú)特的生物活性[9-12]。本研究擬采用試管二倍稀釋法測(cè)定DMY-Ni對(duì)白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株和30例臨床分離株的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度，研究其體外抗菌活性，同時(shí)構(gòu)建白假絲酵母菌陰道炎小鼠模型，初步探討DMY-Ni治療小鼠白假絲酵母菌陰道炎的療效，為將來(lái)防治白假絲酵母菌陰道炎及相關(guān)的感染性疾病提供一個(gè)可參考的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及動(dòng)物 白假絲酵母臨床分離株30株，2013年9～12月分離于海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門(mén)診患者的陰道分泌物，并經(jīng)梅里埃公司的全自動(dòng)生物鑒定和藥敏系統(tǒng)鑒定為白假絲酵母菌。白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株，購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心，編號(hào)為ATCC10231。昆明小鼠(SPF級(jí))[海南醫(yī)學(xué)院藥物安全評(píng)價(jià)中心，許可證號(hào)：SCXK(湘)2009-0012]。

1.2 藥物及主要試劑、儀器 DMY-Ni(海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供)，沙氏瓊脂培養(yǎng)基、沙氏液體培養(yǎng)基(規(guī)格：250 g/瓶，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司)，苯甲酸雌二醇注射液(規(guī)格：2ml：4 mg，寧波市三生藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120207)。Ⅱ級(jí)生物安全柜(海爾有限公司)、全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器(美國(guó)致微(廈門(mén))儀器公司)、生化培養(yǎng)箱(上海博迅儀器有限公司)等。

1.3 DMY-Ni體外抗白假絲酵母菌的活性

1.3.1 培養(yǎng)基的制備 按試劑使用說(shuō)明進(jìn)行配制并高壓滅菌處理，4℃冷藏備用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)藥物的配制 稱(chēng)取DMY-Ni0.040 g，用無(wú)菌注射用水溶解，并加入1.8%鹽酸3滴助溶，定容至50ml，此時(shí)藥物的終濃度為800μg/ml，經(jīng)115℃10min高溫滅菌處理后備用。

1.3.3 受試菌的活化 將白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株及臨床分離株接種至沙氏瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h，活化后備用。

1.3.4 菌懸液的制備 將受試菌株編號(hào)排序，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整菌液濃度為1×105CFU/ml備用。

1.3.5 最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定 無(wú)菌條件下將藥物DMY-Ni用沙氏液體培養(yǎng)基以二倍稀釋法將藥物稀釋?zhuān)顾幬锖胁煌瑵舛鹊膽?yīng)用液，分別為：400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.5625μg/ml、0.78125μg/ml共10個(gè)濃度，每管1ml，同時(shí)設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照及藥物空白管。在上述10個(gè)不同藥物濃度及陽(yáng)性對(duì)照管中，每管加入試驗(yàn)菌液0.1ml，充分混勻，置28℃培養(yǎng)48 h，觀察并記錄結(jié)果。在陰性對(duì)照管、藥物空白管無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照管菌株生長(zhǎng)良好的條件下，以肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的試管中所含的藥物最低濃度即為最低抑菌濃度，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3.6 最低殺菌濃度(MBC)測(cè)定 將未見(jiàn)真菌生長(zhǎng)管，每管取出0.01ml培養(yǎng)液接種于沙氏瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h，觀察并記錄結(jié)果。在陰性對(duì)照管、藥物空白管無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照管菌株生長(zhǎng)的條件下，接種于培養(yǎng)基上菌落數(shù)少于5個(gè)的藥物最低濃度即為最低殺菌濃度，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.4 DMY-Ni治療白假絲酵母菌陰道炎的療效

1.4.1 受試菌活化 將白假絲酵母標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231接種于沙氏瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h，活化后備用。

1.4.2 小鼠VVC模型的構(gòu)建 參考Yano等[13]方法構(gòu)建小鼠VVC模型，將SPF級(jí)的雌性昆明小鼠50只，每只小鼠隔日皮下注射2 mg/ml苯甲酸雌二醇油劑0.05ml，連續(xù)三次，使之處于假發(fā)情狀態(tài)，假發(fā)情誘導(dǎo)成功第3、4天連續(xù)小鼠陰道內(nèi)給予接種107數(shù)量白假絲酵母菌(ATCC10231)感染建模。在感染后72 h分別取陰道分泌物進(jìn)行涂片鏡檢和培養(yǎng)，均檢查有假菌絲和芽生孢子的白假絲酵母菌，證實(shí)造模成功。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)分組 將造模成功的小鼠隨機(jī)分為六組，每日分別陰道內(nèi)給予400μg/ml(高劑量組)、200μg/ml(次高劑量組)、100μg/ml(中劑量組)、50μg/ml(低劑量組)DMY-Ni1次，每次30μl，連續(xù)7 d，給予同等劑量無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)的為模型組，未感染的為空白組，每組10只，給藥前及治療7 d后，用50μl PBS液灌洗陰道8～10次，對(duì)沖洗液內(nèi)的白假絲酵母菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，分別統(tǒng)計(jì)給藥前(0 d)，給藥后第8天小鼠陰道內(nèi)菌落數(shù)的變化情況，觀察藥物對(duì)感染小鼠陰道內(nèi)白假絲酵母菌的殺滅或抑制作用。同時(shí)觀察陰道局部病變情況，按“-”，“+”，“++”，“+++”給予評(píng)分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組小鼠陰道內(nèi)菌落數(shù)的比較采用單因素方差分析，各劑量組在給藥前后的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DMY-Ni抗白假絲酵母菌的體外活性測(cè)定 采用試管二倍稀釋法測(cè)定DMY-Ni對(duì)1株白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株和30株臨床分離株的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)，見(jiàn)表1。

表1 DMY-Ni對(duì)白假絲酵母菌的體外抑菌情況

由表1可知，DMY-Ni對(duì)1株白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株和30株臨床分離株均有較強(qiáng)的抗菌活性，MIC分別為6.25～50μg/ml，6.25～50μg/ml，MIC均值為(15.93±9.93)μg/ml，MBC分別為12.5～200μg/ml，12.5～200μg/ml，MBC均值為(87.10±58.32)μg/ml。

2.2 DMY-Ni對(duì)VVC的療效

2.2.1 DMY-Ni對(duì)VVC模型小鼠陰道內(nèi)白假絲酵母菌生長(zhǎng)的影響 給藥前，模型組和4種藥物劑量組與空白組比較，陰道內(nèi)的菌落數(shù)明顯增加(P＜0.01)，而模型組和4種藥物劑量組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明小鼠VVC模型構(gòu)建成功，且模型組與4種藥物劑量組的小鼠感染程度相當(dāng)。給藥后第8天，分別與給藥前(0 d)比較，4種藥物劑量組陰道內(nèi)的菌落數(shù)明顯下降(P＜0.01)，且高劑量組的抗菌效果最顯著，模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

注：與空白組對(duì)照，aP＜0.01；與0 d比較，bP＜0.01。

2.2.2 肉眼觀察陰道局部變化情況 小鼠于接種白色念珠菌后，陰道充血水腫、分泌物增加。經(jīng)過(guò)DMY-Ni治療后小鼠陰道充血水腫等病變逐漸好轉(zhuǎn),分泌物明顯減少，以高劑量組效果更為明顯，見(jiàn)表3。

表3 陰道局部變化觀察

3 討 論

外陰陰道假絲酵母菌病(VVC)是臨床上表現(xiàn)為婦女外陰陰道炎癥的常見(jiàn)疾病，影響著廣大婦女的身心健康。該病的發(fā)病與多種因素有關(guān)，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，劉朝暉等[14]認(rèn)為，VVC發(fā)生的重要原因在于機(jī)體的免疫異常和陰道環(huán)境的改變，如長(zhǎng)期使用抗菌藥物、免疫抑制藥物、激素或營(yíng)養(yǎng)失調(diào)等都可促使其發(fā)生。治療上常以唑類(lèi)藥物抗真菌為主，效果確切，但在殺滅致病菌的同時(shí)也破壞了陰道的正常菌群，且存在藥物濫用和診治的不規(guī)范等諸多問(wèn)題，使得病原菌的耐藥性明顯增加。二氫楊梅素(DMY)是具有抗菌、抗病毒等作用的黃酮類(lèi)化合物，與金屬離子螯合形成配合物后，金屬離子與配體二氫楊梅素可能產(chǎn)生協(xié)同作用，通過(guò)改變藥物的立體構(gòu)型、分子大小、脂溶性和電荷性等，對(duì)靶細(xì)胞和受體的選擇性增加，從而達(dá)到提高抑菌和殺菌效果療效、降低毒副作用和耐藥性[15-16]。

本課題組以黃酮類(lèi)二氫楊梅素和乙酸鎳鹽為原料，合成二氫楊梅素-鎳配合物，通過(guò)紅外光譜、紫外光譜、差熱-熱重分析對(duì)配合物進(jìn)行表征。本研究對(duì)DMY-Ni在體外對(duì)白假絲酵母菌的MIC、MBC進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明DMY-Ni對(duì)31株受試白假絲酵母菌株均有較強(qiáng)的抗真菌活性；同時(shí)模擬小鼠VVC模型，探討DMY-Ni治療小鼠VVC的療效，通過(guò)陰道內(nèi)給藥，7 d后對(duì)陰道內(nèi)的白假絲酵母菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)及局部病變進(jìn)行觀察，結(jié)果表明DMY-Ni體內(nèi)對(duì)白假絲酵母菌表現(xiàn)出明顯的抑菌、殺菌作用且小鼠陰道局部充血、水腫等病變逐漸好轉(zhuǎn),以高劑量組更為明顯，這為臨床治療VVC提供一個(gè)可參考的途徑。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，DMY-Ni的4種劑量組對(duì)小鼠陰道內(nèi)均無(wú)明顯的刺激性，但整體對(duì)陰道組織的病理結(jié)果、陰道粘膜免疫及對(duì)機(jī)體的細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)水平有何影響，有待后續(xù)深入研究。

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Study on the anti-Candida albicans acitivity of Dihydromyricetin-Nickel complex in vivo and in vitro.

YANG Wen1,MAI Ming-xiao2,LI Hai-xia3,WANG Ying1,ZHOU Zhen-jian1,LI Wen-guang1.1.School of Tropical and Laboratory Medicine,Hainan Medical University,Haikou571101,Hainan,CHINA;2.School of Basic Medicine,Hainan Medical University,Haikou571101,Hainan,CHINA;3.College of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the anti-Candida albicansacitivity of Dihydromyricetin-Nickel complex (DMY-Ni complex)in vitro,and to explore the efficacy of DMY-Ni complex for treating mice model of vulvovaginitis candidiasis(VVC).MethodsTube double dilution method is used to determine theminimum inhibitory concentrations(MICs)andminimum bactericidal concentrations(MBCs)value of DMY-Ni complex toCandida albicans(samples were isolated from the vaginal secretions of30 out-patients in the Affiliated Hospital of Hainan Medical College).At the same time,we established mice model of VVC,and DMY-Ni complex as vaginal drug delivery was assigned to observe the efficacy for VVC mice model.The data were analyzed using statistical software SPSS17.0 single factor analysis of variance andttest comparative analysis.ResultsDMY-Ni complex has strong activityin vitroagainstCandida albicanswith MIC ranging from6.25μg/ml to50μg/ml and MBC ranging from12.5μg/ml to200μg/ml.Compared with the mice model of VVC,four kinds of DMY-Ni complex concentration could significantly reduce the colony number ofCandida albicansin vagina(P＜0.05 orP＜0.01).Vaginal local symptoms gradually improved,and high dose group had the best therapeutic effect.ConclusionFour doses DMY-Ni complex all have significant therapeutic effect in the VVC mice,and the effect of high dose group is superior to that of other three dose groups.The results can provide reference for the treatment of VVC.

Dihydromyricetin-Nickel complex;Candida albicans;Antimicrobial activity

R711.34

A

1003—6350（2015）16—2341—04

2015-03-17)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.16.0846

海南醫(yī)學(xué)院科研培育基金（編號(hào)：2014-014）

麥明曉。E-mail：513108069@qq.com