康銀輝，魏 波，祝兆波，郭偉雄，王朝軍，宋麗君，林 顥，李廣盛，楚佳奇，曾 榮

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科中心1、生殖中心2，廣東 湛江 524001)

皮質(zhì)酮濃度對(duì)SD大鼠成骨細(xì)胞成骨基因表達(dá)的影響

康銀輝1，魏 波1，祝兆波1，郭偉雄1，王朝軍1，宋麗君2，林 顥1，李廣盛1，楚佳奇1，曾 榮1

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科中心1、生殖中心2，廣東 湛江 524001)

目的 探討皮質(zhì)酮對(duì)離體SD大鼠成骨細(xì)胞功能的影響。方法采用多次膠原酶組織消化法獲得新生SD大鼠顱骨中的成骨細(xì)胞作為研究對(duì)象，用倒置顯微鏡及堿性磷酸酶、鈣結(jié)節(jié)染色觀察成骨細(xì)胞形態(tài)，CCK-8法檢測(cè)皮質(zhì)酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響，根據(jù)CCK-8結(jié)果將SD大鼠成骨細(xì)胞分成四組，分別用含不同濃度的皮質(zhì)酮(0μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L)的DMEM(H)培養(yǎng)基培養(yǎng)，作用24 h后，測(cè)定成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶含量，采用RT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)COL1A、OCN、ALP基因表達(dá)，采用Western blot檢測(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果CCK-8結(jié)果顯示皮質(zhì)酮能抑制成骨細(xì)胞的增殖，皮質(zhì)酮能抑制成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的生成，與濃度明顯相關(guān)；RT-PCR與Western blot檢測(cè)可見COL1A、OCN、ALP基因表達(dá)及COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表達(dá)下降。結(jié)論皮質(zhì)酮在超生理劑量的濃度下能抑制成骨細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的合成，減少COL1A、OCN、ALP基因及COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表達(dá)。

皮質(zhì)酮；成骨細(xì)胞；基因表達(dá)；成骨

糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids，GCs)被廣泛用來(lái)治療過(guò)敏性、自身免疫性和炎癥性疾病，但是，長(zhǎng)期、高劑量應(yīng)用會(huì)引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，如骨壞死[1]和骨質(zhì)疏松癥[2]。由于糖皮質(zhì)激素良好的臨床療效，很多患者必須長(zhǎng)期使用，因此研究糖皮質(zhì)激素對(duì)成骨細(xì)胞的影響有重要意義。本文采用體外培養(yǎng)的大鼠顱骨成骨細(xì)胞，給予不同濃度的皮質(zhì)酮，觀察其對(duì)成骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶、成骨功能蛋白及相關(guān)基因表達(dá)的變化，闡述糖皮質(zhì)激素對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)新生24 h內(nèi)的SD乳鼠10只，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。主要試劑：皮質(zhì)酮(日本梯希愛(ài))，茜素紅S (上海華東試劑公司)，PCR引物(上海生物工程)，蛋白抗體(SANTA CRUZ公司)，CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)研究所)，堿性磷酸酶(AKP)試劑盒(南京建成)。

1.2 成骨細(xì)胞的提取 新生24 h內(nèi)SD大鼠胎鼠提取成骨細(xì)胞；無(wú)菌取下胎鼠顱骨放入無(wú)菌PBS中浸泡并剔去骨膜等物質(zhì)，然后用剪刀將顱骨頭剪成(1×1)mm3大小的組織塊，移至15 ml離心管中，加入5 ml 0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化30 min，去掉胰蛋白酶后加入含0.2%的Ι型膠原酶的消化液消化，消化6個(gè)循環(huán)，每次在37℃水浴消化30 min，取第3、4、5、6次消化的細(xì)胞懸液，1 300 r離心10 min，棄上清，沉淀的細(xì)胞用不含血清的高糖DMEM洗劑離心1次，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸吹打均勻后，以1×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，放入5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液，以后每2～3 d換液并在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)至半?yún)R合鋪滿瓶底時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代。

1.3 成骨細(xì)胞的鑒定 成骨細(xì)胞形態(tài)觀察:每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)。將傳到第三代的細(xì)胞以2×105個(gè)/ml接種到鋪有蓋玻片的六孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，3～4 d后將蓋玻片撈出進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶染色，倒置顯微鏡下觀察。茜素紅染色：稱取0.1 g茜素紅粉劑溶于100 ml蒸餾水中配成0.1%的茜素紅溶液，將爬片10～14 d后的蓋玻片撈出，用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕沖洗兩遍，用0.1%的茜素紅溶液染色30 min后蒸餾水沖洗兩遍，封片，倒置顯微鏡下觀察。

1.4 成骨細(xì)胞增殖能力分析 將傳到第三代的細(xì)胞以5×104/ml密度接種于96孔板，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，使細(xì)胞完全貼壁。以0μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L、100μmol/L的皮質(zhì)酮作用24 h后，以CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.5 細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶含量測(cè)定 根據(jù)CCK-8的結(jié)果將實(shí)驗(yàn)分成四組，分別設(shè)0μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L四個(gè)不同的濃度。將傳到第三代的細(xì)胞以5×104/ml密度接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞完全貼壁后，棄培養(yǎng)基，再加入皮質(zhì)酮作用濃度分別為0μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白，蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，再根據(jù)堿性磷酸酶(AKP)試劑盒說(shuō)明測(cè)定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶含量。

1.6 細(xì)胞內(nèi)COL1A、OCN、ALP基因表達(dá)量檢測(cè) 以105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接于6孔板中,加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，再加入皮質(zhì)酮作用濃度分別為0μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后提取總RNA，經(jīng)過(guò)濃度測(cè)定、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。COL1A、OCN、ALP和內(nèi)參β-actin引物序見圖1。反應(yīng)條件為首先95℃變性30 s；然后按95℃5 s，60℃20 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。每個(gè)組的標(biāo)本重復(fù)三次。在反應(yīng)的第二階段，在每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號(hào)強(qiáng)度，60℃～95℃間進(jìn)行融解曲線分析，以分析反應(yīng)中引物的特異性。測(cè)得的Ct值來(lái)計(jì)算每個(gè)樣本目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

圖1 PCR引物序列(F：正向引物，R：反向引物)

1.7 細(xì)胞內(nèi)COL1A、OCN、RUNX-2蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Westernblot法。提取各組細(xì)胞總蛋白，蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，與5×上樣緩沖液混合，100℃變性5 min。各種一抗以1:1 000稀釋，內(nèi)參(GAPDH)按1:2 000稀釋，二抗按1:5 000稀釋。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞的分離與鑒定 成骨細(xì)胞倒置顯微鏡觀察：原代細(xì)胞培養(yǎng)1 d后貼壁，細(xì)胞呈梭形、多角形，7～10 d單層鋪滿瓶壁。傳代細(xì)胞多為梭形(圖2)。堿性磷酸酶(ALP)染色：取第三代細(xì)胞做堿性磷酸酶(ALP)染色，呈棕黃色為陽(yáng)性(圖3)。茜素紅(鈣化結(jié)節(jié)染色)染色：細(xì)胞匯合時(shí)均呈多層重疊生長(zhǎng)，細(xì)胞局部堆集成灶狀，形成鈣結(jié)節(jié)，染色后鈣結(jié)節(jié)呈橘紅色(圖4)。

2.2 不同濃度皮質(zhì)酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響 CCK-8示：高濃度皮質(zhì)酮對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用，隨著濃度增加，對(duì)細(xì)胞增殖抑制明顯增加，地塞米松濃度在0.01～100 μmol/L均可抑制細(xì)胞增殖，并呈濃度依賴性(與對(duì)照組比較，P＜0.05)，見圖5。

2.3 皮質(zhì)酮作用后成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)含量測(cè)定 成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)含量測(cè)定顯示在皮質(zhì)酮濃度為0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L時(shí)，與對(duì)照比較，ALP含量呈下降趨勢(shì)，呈濃度依賴性(與對(duì)照組比較，P＜0.05)，見圖6。

2.4 應(yīng)用皮質(zhì)酮后熒光定量PCR測(cè)定成骨細(xì)胞內(nèi)COL1A、OCN、ALP基因表達(dá) 從測(cè)定的結(jié)果可以看出當(dāng)不同的濃度的皮質(zhì)酮分別作用成骨細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)COL1A、OCN、ALP表達(dá)總體呈下降趨勢(shì)，其中COL1A、ALP基因表達(dá)在皮質(zhì)酮濃度為10.0μmol/L，比皮質(zhì)酮濃度為0.1μmol/L、1.0μmol/L稍有升高(與對(duì)照組比較，P＜0.05)，見圖7。

圖2 原代細(xì)胞鋪滿成骨細(xì)胞(40×)

圖3 堿性磷酸酶染色(100×)

圖4 茜素紅S染色(40×)

圖5 皮質(zhì)酮作用成骨細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率(與對(duì)照組比較，aP＜0.05)

圖6 皮質(zhì)酮作用成骨細(xì)胞24 h后細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶含量(與對(duì)照組比較，aP＜0.05)。

圖7 不同濃度的皮質(zhì)酮對(duì)成骨細(xì)胞作用24 h后對(duì)細(xì)胞內(nèi)COL1A、OCN、ALP基因表達(dá)的影響(與對(duì)照組比較，aP＜0.05)

2.5 蛋白免疫印跡檢測(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表達(dá)量 皮質(zhì)酮0μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L分別作用成骨細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較，成骨細(xì)胞內(nèi)COL1A、OCN、RUNX-2蛋白表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)，其中COL1A在皮質(zhì)酮濃度為10.0μmol/L時(shí)與對(duì)照組比較有明顯差異，OCN、RUNX-2在皮質(zhì)酮濃度為1.0μmol/L、10.0μmol/L出現(xiàn)明顯差異，三種基因的表達(dá)的下降均與皮質(zhì)酮濃度相關(guān)(與對(duì)照組比較，P＜0.05)，見圖8。

圖8 蛋白免疫印跡檢測(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表達(dá)量(與對(duì)照組比較，aP＜0.05)

3 討 論

目前糖皮質(zhì)激素在臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛，相應(yīng)的其應(yīng)用并發(fā)癥也越來(lái)越多，目前，糖皮質(zhì)激素對(duì)機(jī)體骨骼系統(tǒng)影響的機(jī)制仍不明確，存在高凝低纖溶微血管血栓栓塞學(xué)說(shuō)、脂肪代謝紊亂學(xué)說(shuō)、骨內(nèi)高壓學(xué)說(shuō)、二次碰撞學(xué)說(shuō)、遺傳以及基因多態(tài)性學(xué)說(shuō)等[3-5]。

Ogoshi等[6]發(fā)現(xiàn)地塞米松能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡，這種作用與地塞米松的濃度密切相關(guān)。Xu等[7]發(fā)現(xiàn)地塞米松作用小鼠4周后，其成骨細(xì)胞凋亡增加3倍，28%的皮質(zhì)骨干骺端骨細(xì)胞凋亡。已經(jīng)有大量研究表明，超生理劑量的糖皮質(zhì)激素能抑制成骨細(xì)胞的骨生成活性，促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收活性，最終導(dǎo)致骨量不可逆丟失，形成骨質(zhì)疏松癥[8-10]。

近來(lái)有關(guān)的研究表明，糖皮質(zhì)激素可以通過(guò)脂肪細(xì)胞來(lái)間接的影響成骨細(xì)胞的增殖、分化及功能。激素抑制骨髓內(nèi)骨髓間充值干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Cbfa1/ Runx2表達(dá)，促使特異性轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的表達(dá)，從而促使骨髓間從質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，抑制其向成骨細(xì)胞的分化，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞數(shù)量/成骨細(xì)胞數(shù)量比例增加[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)以SD大鼠原代成骨細(xì)胞為研究對(duì)象，CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，不同濃度皮質(zhì)酮對(duì)成骨細(xì)胞的增殖均有抑制作用，并呈濃度依賴性。文獻(xiàn)報(bào)告生理劑量的激素(≤10-8mol/L)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，然而超生理劑量的激素降低成骨細(xì)胞的活性，抑制成骨細(xì)胞的分化[13-15]。因此結(jié)合CCK-8試驗(yàn)本文采用的0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L為超生理劑量用于實(shí)驗(yàn)。

ALP能使局部鈣、磷濃度升高，有助于礦物質(zhì)化的正常進(jìn)行，是促進(jìn)骨間質(zhì)礦化的重要酶，目前認(rèn)為ALP活性的高低是反應(yīng)成骨成熟、功能狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)，成骨細(xì)胞內(nèi)的COL1A、OCN、RUNX-2均是成骨細(xì)胞成骨功能的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度皮質(zhì)酮作用成骨細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶含量、基因、蛋白表達(dá)均呈下降趨勢(shì)；熒光定量PCR結(jié)果顯示不同濃度皮質(zhì)酮作用成骨細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的COL1A、OCN基因表達(dá)都呈下降趨勢(shì)，蛋白免疫印跡檢測(cè)顯示成骨細(xì)胞內(nèi)COL1A、OCN、RUNX-2蛋白表達(dá)下降，并與皮質(zhì)酮?jiǎng)┝棵黠@相關(guān)。因此，皮質(zhì)酮能抑制成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶量、COL1A、OCN、ALP基因及COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表達(dá)。

本文結(jié)果提示皮質(zhì)酮在超生理劑量濃度時(shí)能抑制上述指標(biāo)，對(duì)成骨細(xì)胞成骨活性起著抑制效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于僅做了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，還需進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

[1] Liu H,Yang X,Zhang Y,et al.Fullerol antagonizes dexamethasone-induced oxidative stress and adipogenesis while enhancing osteogenesis in a cloned bone marrow mesenchymal stem cell[J]. Journal of Orthopaedic Research,2012,30(7):1051-1057.

[2]Duyvendak M,Naunton M,van Roon EN,et al.Doctors’beliefs and knowledge on corticosteroid-induced osteoporosis:identifying barriers to improve prevention[J].Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics,2011,36(3):356-366.

[3]Mont MA,Jones LC,Hungerford DS.Nontraumatic osteonecrosis of the femoral head:ten years later[J].The Journal of Bone&Joint Surgery,2006,88(5):1117-1132.

[4]McGrory BJ,York SC,Iorio R,et al.Current practices of AAHKS members in the treatment of adult osteonecrosis of the femoral head [J].The Journal of Bone&Joint Surgery,2007,89(6):1194-1204.

[5]Lieberman JR,Berry DJ,Mont MA,et al.Osteonecrosis of the hip: management in the 21st century[J].Instructional Course Lectures, 2002,52:337-355.

[6]Ogoshi T,Hagino H,Fukata S,et al.Influence of glucocorticoid on bone in 3-,6-,and 12-month-old rats as determined by bone mass and histomorphometry[J].Modern Rheumatology,2008,18(6): 552-561.

[7]Xu J,Liu X,Chen J,et al.Simvastatin enhances bone marrow stromal cell differentiation into endothelial cells via notch signaling pathway[J].American Journal of Physiology-Cell Physiology, 2009,296(3):535-543.

[8]Maricic M.Update on glucocorticoid-induced osteoporosis[J].Rheumatic Disease Clinics of NorthAmerica,2011,37(3):415-431.

[9]Hoeppner LH,Secreto FJ,Westendorf JJ.Wnt signaling as a therapeutic target for bone diseases[J].Expert Opin Ther Targets,2009, 13(4):485-496.

[10]Bonewald LF,Johnson ML.Osteocytes,mechanosensing and Wnt signaling[J].Bone,2008,42(4):606-615.

[11]Ren D,Collingwood TN,Rebar EJ,et al.PPARγknockdown by engineered transcription factors:exogenous PPARγ2 but not PPARγ1 reactivates adipogenesis[J].Genes&Development,2002,16(1):27-32.

[12]Li X,Jin L,Cui Q,et al.Steroid effects on osteogenesis through mesenchymal cell gene expression[J].Osteoporosis International, 2005,16(1):101-108.

[13]Rauch A,Seitz S,Baschant U,et al.Glucocorticoids suppress bone formation by attenuating osteoblast differentiation via the monomeric glucocorticoid receptor[J].Cell Metabolism,2010,11(6):517-531.

[14]Kitase Y,Barragan L,Qing H,et al.Mechanical induction of PGE2 in osteocytes blocks glucocorticoid-induced apoptosis through both theβ-catenin and PKA pathways[J].Journal of Bone and Mineral Research.2010,25(12):2657-2668.

[15]Xia X,Kar R,Gluhak-Heinrich J,et al.Glucocorticoid-induced autophagy in osteocytes[J].J Bone Miner Res,2010,25(11):2479-2488.

Effect of corticosterone concentration on osteoblastic gene expression of SD rat osteoblasts.

KANG Yin-hui1,WEI Bo1,ZHU Zhao-bo1,GUO Wei-xiong1,WANG Chao-jun1,SONG Li-jun2,LIN Hao1,LI Guang-sheng1,CHU Jia-qi1, ZENG Rong1.Orthopedic Centre1,Lab of Reproductive Medicine2,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of different corticosterone concentration on the gene expression of SD rat osteoblastsin vitro.MethodsNewborn SD rat osteoblasts in the skull were obtained by many times of collagenase digestion as the object of study.The osteoblastic morphology was observed using inverted microscope,alkaline phosphatase and calcium nodes dyeing.And the effect of corticosterone concentration on osteoblastic proliferation was detected by CCK-8.According to the scores of CCK-8,the SD rat osteoblasts were divided into four groups with different corticosterone concentrations of DMEM(H)culture(0 μmol/L,0.1 μmol/L,1.0 μmol/L,10.0 μmol/L). After 24 hours of DMEM(H)culture,content of osteoblastic alkaline phosphatase were measured,gene expressions of osteoblastic COL1A,OCN,ALP were detected by RT-PCR,and the protein expression of osteoblastic COL1A, OCN,RUNX-2 were measured by western blot.ResultsThe scores of CCK-8 showed that corticosterone can restrain the proliferation of SD rat osteoblasts and the formation of osteoblastic alkaline phosphatase,which were significantly related to concentration.And the results of RT-PCR and western blot both showed decreased expression of COL1A,OCN,ALP gene and COL1A,OCN,RUNX-2 protein.ConclusionCorticosterone beyond physical dosage can inhibit the proliferation of osteoblasts and synthesis of intracellular alkaline phosphatase,and reduce the expression of COL1A,OCN,ALP gene and COL1A,OCN,RUNX-2 protein.

Corticosterone;Osteoblasts;Gene expression;Osteogenesis

R-332

A

1003—6350（2015）18—2661—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0969

2015-05-12)

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2011B031800172）

魏 波。E-mail：webjxmc@163.com